高等真核細胞DNAポリメラーゼεの機能解析

高等真核DNA聚合酶ε的功能分析

• 批准号: 10162214
• 负责人: 宮澤 宏
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: 国立公衆衛生院
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10162214/
• 关键词: DNAポリメラーゼε; DNA複製; サブユニット構造; 過剰発現系; 核移行

DNAポリメラーゼε(polε)の2つのサブユニットの機能を明らかにする目的で、SRαのプロモーターの下流に結合したcDNAをCOS細胞へ導入し、2日後の核抽出液のDNAポリメラーゼ活性を検討した。DNAポリメラーゼα等の活性によるバックグランドは高いものの、polε活性サブユニット(p260)を単独発現させた場合、活性の上昇が見られた。サブユニット構造をとっているpolεは、p260単独で活性が存在することが示唆された。また、2番目のサブユニット(DPB2)と同時に発現させた場合、さらに活性の上昇が見られた。この時同時に行ったWestern blottingの結果から、この活性の上昇はDPB2を同時に発現させたためp260自体のタンパク量も上昇したことに起因することが判明した。一部欠損させたp260を作製し、同様にして活性を測定したところ、N末の65個のアミノ酸、およびC末のZinc fingerを含む660個あまりのアミノ酸を欠損させても、目立った活性の低下はなかった。したがって、この領域に存在するZinc fingerや酸性アミノ酸領域は活性発現に必須ではないと結論された。2つのサブユニットは核で機能するタンパク質であり、その核移行のメカニズムを調べる目的で、各抗体を用いてそれぞれの細胞内局在を調べた。内在性のpolεは両サブユニットとも核に局在していた。次に過剰発現系での細胞内局在を調べた。その結果p260は単独発現させた場合でも核に局在したことから、p260自身に核移行シグナルが存在するものと示唆された。一方、DPB2は核にも見られるが主に細胞質に存在していた。2つのサブユニットを同時発現させると、細胞質に残るDPB2もあるが、核に局在する割合が増加したことから、DPB2は活性サブユニットと複合体を形成して核へ移行すると考えられた。

DNA ポ リ メ ラ ー ゼ epsilon (pol epsilon) の 2 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト の function を Ming ら か に す る purpose で, SR alpha の プ ロ モ ー タ ー の obscene に combining し た cDNA を COS cell へ import し, 2 の future nuclear extract DNA ポ の リ メ ラ ー ゼ active を beg し 検 た. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha の activity such as に よ る バ ッ ク グ ラ ン ド は high い も の の, pol epsilon active サ ブ ユ ニ ッ ト (p260) を 単 発 alone now さ せ た rise occasion, active の が see ら れ た. サ ブ ユ ニ ッ ト tectonic を と っ て い る pol epsilon は, p260 単 で active が exist alone す る こ と が in stopping さ れ た. Youdaoplaceholder0, the second-order <s:1> サブユニット(DPB2)と simultaneously に occurred in させた cases, and the さらに activity <s:1> increased が as seen in られた. Line at the same time when こ の に っ た Western blotting の results か ら, こ の active の rise は DPB2 を simultaneously に 発 now さ せ た た め p260 autologous の タ ン パ ク quantity rising も し た こ と に cause す る こ と が.at し た. A less loss さ せ た p260 し, with others in the を cropping に し て determination of active を し た と こ ろ, N の at the end of the 65 の ア ミ ノ acid, お よ び C at the end of the の any Zinc finger を containing む 660 あ ま り の ア ミ ノ acid を owe loss さ せ て も, eye っ た active low の は な か っ た. し た が っ て, こ に の field exist す る any Zinc finger や acid ア ミ ノ は active acid field 発 に must now で は な い と conclusion さ れ た. 2 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト は function of nuclear で す る タ ン パ ク qualitative で あ り, そ の nuclear migration の メ カ ニ ズ ム を adjustable べ で る purpose, each antibody を い て そ れ ぞ れ の cells inside bureau in を adjustable べ た. The intrinsic <s:1> polε た and サブユニットと に nuclear に is located in the <s:1> て た た た. The subsequent に occurrence is the で で intracellular localization in を べた. そ の results p260 は 単 発 alone now さ せ た occasions で も nuclear に bureau in し た こ と か ら, p260 に nuclear migration シ グ ナ ル が exist す る も の と in stopping さ れ た. One side, the <s:1> nucleus of DPB2 に に is found to be られるが, and the main に cytoplasm に exists in て て た た. 2 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト を simultaneously 発 now さ せ る と, cytoplasmic に residual る DPB2 も あ る が, nuclear に bureau in す る cut close が raised plus し た こ と か ら, DPB2 は active サ ブ ユ ニ ッ ト と complex を form し て nuclear へ transitional す る と exam え ら れ た.

项目成果

MIZUNO T.: "The second-largest subunit of the mouse DNA polymerase α-primase complex facilitates both preduction and nuclear translocation of the ratalytic subunit of DNA polymerase α" Mol. Cell. Biol.18・6. 3552-3562 (1998)

MIZUNO T.：“小鼠 DNA 聚合酶 α-引物酶复合物的第二大亚基促进 DNA 聚合酶 α 催化亚基的产生和核转位”，Mol.18·6（1998）。