微小管モーターとその変異体を用いた分子モーター作用機構の階層論的研究

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野性型の分子モータは,細胞骨格繊維と相互作用すると,そのATP分解が活性化され,繊維の一方向性の滑り運動を生じる。分子モータの或る変異体は,野性型分子モータと同様にATP分解は繊維によって活性化されるが,繊維の一方向性の滑り運動を起こすことができず,繊維の一次元的な「双方向性」のランダム運動を起こす。これらの変異体によって生じる繊維の一次元的ランダム運動を非線形動力学解析法などをもちいて詳細に解析することにより,野性型分子モータにあって,これらの変異体モータに欠けているメカニズムを見いだし,分子モータが活性化型ATP分解に共役して「一方向性」の滑り力を能動的に発生する仕組みの解明を目指すのが本研究の目的である。1. 上記の特徴を持つ変異体分子モータとして,微小管モータのひとつであるNCDの,柄部の短い変異体MC5を本研究で用いる。まずGST-MC5という融合タンパクを,大腸菌を用いて発現し,精製単離した。GST-MC5をin vitro滑り運動測定セル中のガラス面に固定して,そのセル中に微小管を加えると、GST-MC5のATP分解が活性化されることを確かめた。次に,GST-MC5をスロンビン処理することで,MC5を切り出したが,分子量的に少し異なる2種類の標本を得た。スロンビンが融合タンパクの異なる2か所を切断するからであることが判明した。2. そこで,単一分子量のMC5を調整するために大腸薗でMC5を直接発現することにした。そのために,現在,pGEX-MC5からPCRでMC5を取り出し,新しくpET-MC5を構築中である。外注したPCR用のプライマーに作成ミスが2度も有ったので、このMC5のベクターの構築が予想より遅れている。3. 実験的に観察されている8nm以下のキネシン・ステップサイズを説明する理論を作った。そして、その計算機実験で8nm以下のステップの生じることを示した。この結果は現在論文に執筆中である。