単一分子によるタンパクと生体膜の結合解析:膜骨格タンパクと赤血球膜をモデルとして

单分子蛋白质与生物膜的结合分析：以膜骨架蛋白和红细胞膜为模型

• 批准号: 10877022
• 负责人: 高桑 雄一
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877022/
• 关键词: 4.1タンパク; PSリポソーム; 自己相関蛍光測定法(FCS); 単一タンパク分子; Ca^<2+>-Calmodulin; リン酸化; phospholipase; 自己蛍光相関蛍光法; 4.1タンパク質; 赤血球; ホスファチジルセリン(PS); バンド3; 反転膜小胞

これまで、4.1タンパクとPSリポソームを例に自己相関蛍光測定法(FCS)を用いて単一タンパク分子の「ゆらぎ」を測定することにより、タンパクと膜脂質の相互作用を解析することができることを初めて示した。本研究では、FCSを用いてこれらの相互作用に関わる調節因子、化学修飾の効果について検討し、従来の生化学的手法を用いた結果と比較した。実際には、rhodamine標識精製4.1タンパク(またはその30kDaドメイン)と人工脂質膜(PSリポソーム)または生体膜(赤血球反転小胞膜、肥満細胞顆粒膜)の結合におけるCa^<2+>-calmodulinの4.1タンパクへの結合、4.1タンパクのリン酸化、リポソームのphospholipase(PLA2など)処理の効果について解析した。1)Ca^<2+>-calmodulinの効果:4.1タンパクの「ゆらぎ」の拡散係数は分子量の大きな粒子(人工脂質膜、生体膜)に結合することで増大した。Ca^<2+>-calmodulinの添加により生体膜との結合は低下したが(拡散係数の低下)、人工脂質膜との結合は変わらなかった。また、予めCa^<2+>-calmodulinを結合させた4.1タンパクは生体膜に結合せず、人工脂質膜には結合した。これらの結果は、4.1タンパクと生体膜貫通タンパクとの結合がCa^<2+>-calmodulinにより抑制される従来の生化学的実験結果と合致した。2)phospholipase処理の効果:PSリポソームをPLA2処理することにより、一旦結合した4.1タンパクは遊離した。(拡散係数の低下)。遊離した4.1タンパクは脂肪酸を結合しており、pI、CDスペクトルの大きな変化から、構造変化が示された。3)リン酸化の効果:PKCによりリン酸化した4.1タンパクは、生体膜に結合せず、人工脂質膜には結合した(拡散係数の増大)。FCSによって得られる単一分子の「ゆらぎ」の情報から、タンパクと膜脂質および膜貫通タンパクとの相互作用、それらの調節について解析できることが4.1タンパクを例に示された。これらの結果に基づき、ひとつの細胞内での4.1タンパクの動態解析への応用を今後試みる予定である。

こ れ ま で, 4.1 タ ン パ ク と PS リ ポ ソ ー ム を instance に himself masato 蛍 light measurement (FCS) を い て 単 a タ ン パ ク molecular の "ゆ ら ぎ" を determination す る こ と に よ り, タ ン パ ク と interaction between membrane lipids の を parsing す る こ と が で き る こ と を early め て in し た. This study で は, FCS を with い て こ れ ら の interaction に masato わ る adjustment factor, chemically modified の unseen fruit に つ い て beg し 検, 従 の biochemical technique を with い た results と し た. Be interstate に は, rhodamine identification of refined 4.1 タ ン パ ク (ま た は そ の 30 kda ド メ イ ン) と bilayer lipid membrane (PS リ ポ ソ ー ム) ま た は raw body mask (red blood cell against planning small cell membrane, fat particles against cell membrane) の combining に お け る Ca ^ 2 + > < - calmodulin の 4.1 タ ン パ ク へ の combination, 4. 1 タ ン パ ク の リ ン acidification, リ ポ ソ ー ム の phospholipase (PLA2 な ど) 処 Richard の unseen fruit に つ い て parsing し た. 1) Ca ^ 2 + > < - calmodulin の unseen fruit: 4.1 タ ン パ ク の "ゆ ら ぎ" の company, dispersion coefficient は の large molecular weight き な particles (bilayer lipid membrane, membrane) に combining す る こ と で raised large し た. Ca ^ 2 + > < - calmodulin の add に よ り raw body membrane と の combined with low は し た が (の company, dispersion coefficient is low), bilayer lipid membrane と の combining は - わ ら な か っ た. ま た, to め Ca ^ 2 + > < - calmodulin を combining さ せ た 4.1 タ ン パ ク は raw body membrane に combining せ ず bilayer lipid membrane, に は combining し た. こ れ ら の results は, 4.1 タ ン パ ク と raw body transmembrane タ ン パ ク と の combining が Ca ^ 2 + > < - calmodulin に よ り inhibit さ れ る 従 to の biochemistry of be と 験 results close to し た. 2) phospholipase 処 Richard の unseen fruit: PS リ ポ ソ ー ム を PLA2 処 Richard す る こ と に よ り, once combined with し た 4.1 タ ン パ ク は free し た. The dispersion coefficient of (拡 is low). Free し た 4.1 タ ン パ ク を は fatty acids combined with し て お り, pI, CD ス ペ ク ト ル の big き な variations change か ら, structural variations が shown さ れ た. 3) リ ン acidification の unseen fruit: PKC に よ り リ ン acidification し た 4.1 タ ン パ ク は, living body membrane に combining せ ず bilayer lipid membrane, に は combining し た (company, dispersion coefficient の rights). FCS に よ っ て have ら れ る 単 a molecular の "ゆ ら ぎ" の intelligence か ら, タ ン パ ク と membrane lipid お よ び transmembrane タ ン パ ク と の interaction, そ れ ら の adjust に つ い て parsing で き る こ と が 4.1 タ ン パ ク を example に shown さ れ た. こ れ ら の results に づ き, ひ と つ の intracellular で の 4.1 タ ン パ ク の dynamic analytic へ の try を future 応 み る designated で あ る.

项目成果

Takakuwa Y, Kinjo M et al: "Fluorescence correlation spectroscopy analysis of the hydrophobic interactions of protein 4.1 with phosphatidyl serine liposomes"Biophys Chem. 82. 149-155 (1999)

Takakuwa Y、Kinjo M 等人：“蛋白质 4.1 与磷脂酰丝氨酸脂质体疏水相互作用的荧光相关光谱分析”Biophys Chem。

高桑雄一 他: "赤血球" 医学書院(代表取締役)金原 優, 257 (1998)

高桑佑一等人：《红细胞》伊岳书院（代表董事）金原佑，257（1998）

高桑 雄一: "赤血球"医学書院. 257 (1998)

高桑雄一：“红细胞” Igaku Shoin 257 (1998)。

金城政孝 他: "Single molecules analysis of restriction DNA fragweuts using Fluores ceuce Comelation Spectroscopy." Anal.Biochew.260. 166-172 (1998)

Masataka Kinjo 等人：“使用 Fluores ceuce Comelation Spectroscopy 进行限制性 DNA 碎片的单分子分析。Anal.Biochew.266-172 (1998)。

金城政孝 他: "Detection of asymmetric PCR products in homogenous solution by fluoresceuce correlation spectroscopy." Bio Techniques. 25. 706-715 (1998)

Masataka Kinjo 等人：“通过荧光相关光谱法检测均质溶液中的不对称 PCR 产物。”25. 706-715 (1998)。