癌特異的な増殖シグナルを細胞死のシグナルに変換する新しい癌遺伝子治療法の開発

1. 変異K-ras蛋白をターゲットとした癌特異的アポトーシス誘導療法消化器癌の中でも膵癌は極めて予後不良であるが、80から90%の症例に点変異によるK-rasの持続的な活性化が認められる。RT-PCR法を用い、c-rafのN末端に存在するK-ras結合domain、およびFasの細胞内death domainのc DNAを増幅した。この二つのcDNAをCAGプロモーターの下流に直列に接続し、発現ベクターを作成した。このコンストラクトを膵癌細胞株にtransfectし、TUNEL法、電子顕微鏡、DNA ladderingによってアポトーシスを検出しようよした。しかし、細胞死を誘導することはできなかった。2. p53癌抑制遺伝子の機能喪失をターゲットにした癌特異的遺伝子治療ヒト癌の約50%に認められるp53癌抑制遺伝子の機能喪失をターゲットにした癌特異的遺伝子治療のモデル系、具体的にはcre-loxPの制御系を用いてp53のはたらかない癌細胞ではそのまま自殺遺伝子(HSV・tk gene)が発現するが、正常細胞では自殺遺伝子が切り出されて発現しないような治療モデルを作成することを試みた.p53の認識配列5'-TCGACGGACATGCCCGGGCATGTC・.3を2コピー直列に接続した下流に、エンハンサーを除いたHSV-tkプロモーター、そしてcre酵素のcDNAをつないだコンストラクトを作成した。さらにCAGプロモーターの下流にloxPに挟まれたHSV-tk自殺遺伝子を接続したもう一つのベクターを作成した。この系をまずin vitroで検討し、reporter遺伝子でこの発現系のon-off switchを検討したが、まだ満足行く結果は得られていない.

1. 変異K-ras蛋白をターゲットとした癌特異的アポトーシス誘導療法消化器癌の中でも膵癌は極めて予後不良であるが、80から90%の症例に点変異によるK-rasの持続的な活性化が認められる。RT-PCR法を用い、c-rafのN末端に存在するK-ras結合domain、およびFasの細胞内death domainのc DNAを増幅した。この二つのcDNAをCAGプロモーターの下流に直列に接続し、発現ベクターを作成した。このコンストラクトを膵癌細胞株にtransfectし、TUNEL法、電子顕微鏡、DNA ladderingによってアポトーシスを検出しようよした。しかし、細胞死を誘導することはできなかった。2. p53癌抑制遺伝子の機能喪失をターゲットにした癌特異的遺伝子治療ヒト癌の約50%に認められるp53癌抑制遺伝子の機能喪失をターゲットにした癌特異的遺伝子治療のモデル系、具体的にはcre-loxPの制御系を用いてp53のはたらかない癌細胞ではそのまま自殺遺伝子(HSV・tk gene)が発現するが、正常細胞では自殺遺伝子が切り出されて発現しないような治療モデルを作成することを試みた.p53の認識配列5'-TCGACGGACATGCCCGGGCATGTC・.3を2コピー直列に接続した下流に、エンハンサーを除いたHSV-tkプロモーター、そしてcre酵素のcDNAをつないだコンストラクトを作成した。さらにCAGプロモーターの下流にloxPに挟まれたHSV-tk自殺遺伝子を接続したもう一つのベクターを作成した。この系をまずin vitroで検討し、reporter遺伝子でこの発現系のon-off switchを検討したが、まだ満足行く結果は得られていない.