β-グリカンを認識・結合する領域を利用した蛋白質二次元集積化法の開発研究

利用识别并结合β-聚糖的区域研究和开发二维蛋白质整合方法

基本信息

批准号：
11132218
负责人：
森川康
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的はセルラーゼ等のβ-グリカン結合領域を蛋白質工学的に改変して、β-グリカンとの結合を自由自在に制御することであり、これによってバイオ素子やバイオセンサーあるいはバイオターゲッティング素子に利用するための知見を得ることである。糸状菌T.reeseiセルラーゼで唯一セルロース結合領域(CBD)を有しないEG IIIのN末端にセロビオハイドロラーゼI(CBH I)のCBDを、またC末端にCBH IIのCBDを、リンカーとともに結合させた2種のキメラ体遺伝子を構築し、S.pombeで発現させたが、いずれもCMCを基質としたエンド型活性のある形で分泌発現された。これらを精製し、結晶セルロースヘの結合を確認後、各種基質に対する相対活性を測定したところ、特にCBH IのCBDをC末端に結合させたキメラEG IIIのBMCCに対する活性が大幅に上昇した。現在、これらの結果の動力学的な解析を行うとともに、native EG IIIが協奏作用を示すCBHの共存下での結晶セルロース分解能力などを測定することによって、CBDの特性(セルロースの認識・結合能)を評価している。T.reesei由来の全長53kDaのα-L-アラビノフラノシダーゼ(AF53)のC末端約18kDaが欠けた35kDaの短縮型酵素(AF35)は、低分子の合成基質には活性を示すにも拘わらず、高分子キシランに対する活性がなく、かつキシランに対する結合能も欠けており、C末端約18kDa部分にこれまでに報告のない新規なXBDが含まれていることが明らかになった。つぎに、AF53遺伝子をS.pombeで発現させた(27μg/m1)。現在、18kDa部分のC末端側をどこまで短縮すればキシラン結合能力が喪失されるかを検討している。今後、XBD単独で機能することを確認するとともに、N末端側を短縮させた変異体のキシラン結合能を検討することにより、XBDとしての最小領域を確定させる予定である。

这项研究的目的是修改蛋白质工程中的β-聚糖结合区域，例如蛋白质工程中的纤维素酶，以自由控制与β-聚糖的结合，从而获取知识以用于生物元素，生物传感器或生物目标设备。构建了两个嵌合基因，其中纤维二核酸酶I（CBH I）CBD与Eg III的N末端结合，而Eg III没有纤维素结合区域（CBD），并且CBH II CBD与C-terminus结合，并与C-terminus链接，并用S. pombe表示，同时使用了combe的表现，该表现为Endoce neenter in nosective in nosective in no no no no no no no nose nosef。纯化后，确认与结晶纤维素的结合，并测量针对各种底物的相对活性。特别是，具有CBHI的CBD的嵌合III的活性尤其与BMCC显着增加。当前，我们正在对这些结果进行动态分析，并通过测量在CBH存在下分解晶体纤维素的能力，评估CBD（纤维素识别和结合能力）的性能，这表现出天然EG III的一致作用。 The 35 kDa truncated enzyme (AF35) lacking approximately 18 kDa C-terminal end of the α-L-arabinofuranosidase (AF53) from T. reesei, although it is active in the small molecule synthetic substrate, it has no activity against polymeric xylan and lacks ability to bind to xylan, and it has been revealed that the approximately 18 kDa C-terminal portion包含到目前为止尚未报道的新型XBD。接下来，AF53基因在S. pombe（27μg/m1）中表达。目前，我们正在考虑应缩短18KDA部分的C端一侧以失去Xylan结合能力。将来，我们将确认XBD单独起作用，并研究具有降低N末端的突变体的Xylan结合能力，从而确定XBD的最小区域。