β-グリカンを認識・結合する領域を利用する蛋白質二次元集積化法の開発研究

利用识别和结合β-聚糖的区域开发二维蛋白质整合方法的研究

• 批准号: 12019221
• 负责人: 森川 康
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019221/
• 关键词: セルロース結合領域; キシラン結合領域; トリコデルマ・リーセイ; セルラーゼ; α-L-アラビノフラノシダーゼ; キメラ体; エンドグルカナーゼIII; 協奏効果

本研究の目的はセルラーゼ等のβ-グリカン結合領域の特質を理解し、さらには蛋白質工学的に改変してβ-グリカンとの結合を自由自在に制御することであり、これによってバイオターゲッティング素子などにに利用するための知見を得ることである。糸状菌T.reeseiセルラーゼで唯一セルロース結合領域(CBD)を有しないEGIIIのN末端にCBHIのCBDおよびC末端にCBHIIのCBDをリンカーとともに結合させた2種のキメラ体を取得した。これらの結晶セルロースへの結合はnative EGIIIに比べ大幅に増加し、キメラ体のCBDが有効に機能することが明らかとなった。また、キメラEGIIIのリン酸膨潤セルロースや結晶セルロースなど不溶性基質に対する活性がnative EGIIIに比べ約1.5〜2.5倍に上昇した。動力学的な解析を行ったが、Kmだけではなくk_<cat>も増大していることが判明した。さらに、native EGIIIが協奏作用を示すCBHの共存下での結晶セルロース分解能力(協奏効果)を測定した結果、アビセル分解での協奏効果はnative EGIIIと変わらないのに対し、BMCC分解ではnative EGIIIの協奏効果(4.6倍)よりさらに増大し、最大で6.7倍となった。CBDの部位特異的変異は現在進行中である。T.reesei由来の全長53kDaのα-L-アラビノフラノシダーゼ(AF53)のC末端約18kDa部分にこれまでに報告のない新規なXBDが含まれていることが明らかになっている。そこで、AF53のC末端側を約9kDaから27kDaまで欠失させた3種類の変異遺伝子を構築した。現在これらの変異遺伝子をS.pombeのシグナル改良型分泌発現系で発現させている。今後、XBD単独で機能することを確認するとともに、XBDとしての最小領域を確定させる予定である。

这项研究的目的是了解β-聚糖结合区域（例如纤维素酶，以及进一步）通过基于蛋白质工程进行修改来自由控制β-聚糖的特征，从而获得了在生物式式设备中使用的知识。 C-terminus的Egiii和CBHII CBD的N末端与接头结合在一起。与天然EGIII相比，与这些结晶纤维素的结合显着增加，并且发现嵌合CBD有效地功能。此外，与天然EGIII相比，嵌合Egiii对诸如磷酸盐肿胀纤维素和结晶纤维素等不溶性底物的活性增加了约1.5至2.5倍。进行了动态分析，发现不仅KM而且K_ <CAT>也增加了。此外，当测量天然EGIII在存在CBH的情况下分解晶体纤维素时，表现出协同效果时，Avicel分解的一致效果与天然EGIII的共同作用并不相同，而BMCC分解的效果甚至比天然Egiii II（4.6次）（4.6次），最高6.7次。 CBD中的站点定向突变目前正在进行中。据透露，来自T. reesei的53 kDa全长α-l-arabinosidase酶（AF53）的C末端的大约18 kDa部分包含了到目前为止尚未报道的新型XBD。因此，构建了三个突变基因，其中将AF53的C末端从约9 kDa删除至27 kDa。这些突变基因目前正在S. pombe信号改良的分泌表达系统中表达。将来，我们计划确认XBD将单独起作用并确定XBD的最小面积。