変異株を用いた転写制御因子GATAの分解制御の機構

特異的蛋白の分解経路にかかわる因子を遺伝学的に解析することを目指し、ブラストサイジンデアミナーゼ(BSD)遺伝子のプロモーターにGATA-6の結合配列を2個直列につないだ発現プラスミドを構築した。この発現プラスミドを導入したCHO-K1細胞では、GATA蛋白質依存的にBSDを発現し、BS耐性になる。しかしジブチリルcAMPを添加するとGATA-6が分解し、BS耐性が消失する。この細胞にアルキル化剤による変異導入を行い、ジブチリルcAMPが存在しても生育できる変異株細胞を分離5種分離した。これらの細胞では、ゲルシフト法およびウエスタンブロッテイング法によってGATA-6がcAMP存在下に分解しなかった。そこで、これら細胞を用いて、細胞内分解経路(すなわちcAMPからプロテアソームにつながる経路)にかかわる因子を明らかにすることが可能になった。細胞質のプロテアソーム活性測定系や二次元電気泳動による細胞内蛋白質の移動度検定系を構築した。また、GST融合蛋白質として、GATA-6を大腸菌に発現させ精製し、細胞質画分添加による試験管内蛋白分解系の構築も行った。この系により、ジブチリルcAMP処理した細胞の細胞質画分が融合蛋白質の分解を促進した。これらの系を用いて変異株の性状を解析しつつ、変異遺伝子の同定を進めることが可能になった。また、一つの変異株細胞では、cAMPが存在しないときのプロテアソーム活性が低く、少なくとも初期のねらいに沿った変化が変異株に起きていることが明らかになった。

特異的蛋白の分解経路にかかわる因子を遺伝学的に解析することを目指し、ブラストサイジンデアミナーゼ(BSD)遺伝子のプロモーターにGATA-6の結合配列を2個直列につないだ発現プラスミドを構築した。この発現プラスミドを導入したCHO-K1細胞では、GATA蛋白質依存的にBSDを発現し、BS耐性になる。しかしジブチリルcAMPを添加するとGATA-6が分解し、BS耐性が消失する。この細胞にアルキル化剤による変異導入を行い、ジブチリルcAMPが存在しても生育できる変異株細胞を分離5種分離した。これらの細胞では、ゲルシフト法およびウエスタンブロッテイング法によってGATA-6がcAMP存在下に分解しなかった。そこで、これら細胞を用いて、細胞内分解経路(すなわちcAMPからプロテアソームにつながる経路)にかかわる因子を明らかにすることが可能になった。細胞質のプロテアソーム活性測定系や二次元電気泳動による細胞内蛋白質の移動度検定系を構築した。また、GST融合蛋白質として、GATA-6を大腸菌に発現させ精製し、細胞質画分添加による試験管内蛋白分解系の構築も行った。この系により、ジブチリルcAMP処理した細胞の細胞質画分が融合蛋白質の分解を促進した。これらの系を用いて変異株の性状を解析しつつ、変異遺伝子の同定を進めることが可能になった。また、一つの変異株細胞では、cAMPが存在しないときのプロテアソーム活性が低く、少なくとも初期のねらいに沿った変化が変異株に起きていることが明らかになった。