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変異株を用いた転写制御因子GATAの分解制御の機構

利用突变株调控转录调控因子GATA降解的机制

基本信息

批准号：
11144222
负责人：
前田正知
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11144222/
关键词：
DATA因子 GATA6 DNA結合蛋白質転写制御因子 Aキナーゼプロテアソーム変異株

项目摘要

特異的蛋白の分解経路にかかわる因子を遺伝学的に解析することを目指し、ブラストサイジンデアミナーゼ(BSD)遺伝子のプロモーターにGATA-6の結合配列を2個直列につないだ発現プラスミドを構築した。この発現プラスミドを導入したCHO-K1細胞では、GATA蛋白質依存的にBSDを発現し、BS耐性になる。しかしジブチリルcAMPを添加するとGATA-6が分解し、BS耐性が消失する。この細胞にアルキル化剤による変異導入を行い、ジブチリルcAMPが存在しても生育できる変異株細胞を分離5種分離した。これらの細胞では、ゲルシフト法およびウエスタンブロッテイング法によってGATA-6がcAMP存在下に分解しなかった。そこで、これら細胞を用いて、細胞内分解経路(すなわちcAMPからプロテアソームにつながる経路)にかかわる因子を明らかにすることが可能になった。細胞質のプロテアソーム活性測定系や二次元電気泳動による細胞内蛋白質の移動度検定系を構築した。また、GST融合蛋白質として、GATA-6を大腸菌に発現させ精製し、細胞質画分添加による試験管内蛋白分解系の構築も行った。この系により、ジブチリルcAMP処理した細胞の細胞質画分が融合蛋白質の分解を促進した。これらの系を用いて変異株の性状を解析しつつ、変異遺伝子の同定を進めることが可能になった。また、一つの変異株細胞では、cAMPが存在しないときのプロテアソーム活性が低く、少なくとも初期のねらいに沿った変化が変異株に起きていることが明らかになった。

Specific protein decomposition pathway にかかわるfactor を伝学にanalytics することを Eye finger し、ブラストサイジンデアミナーゼ( BSD) のプロモーターにGATA-6 is a combination of two in-line につないだ発成プラスミドをconstructionした.この発成プラスミドをIntroduced into したCHO-K1 cells では, GATA protein-dependent にBSD を発见し, BS-resistant になる.しかしジブチリルcAMPをaddedするとGATA-6がbreakdownし、BS resistanceがdisappearedする.このCell にアルキル剤による変differentiation introduction を行い, ジブチリルcAMP がexisting してもproductive できる変differentiated cells をisolation 5 kinds of isolation した.これらのcellでは、ゲルシフト法およびウエスタンブロッテイング法によってGATA-6 is decomposed in the presence of cAMP.そこで、これら Cell useいて、Intracellular decomposition pathway (すなわちcAMPからプロテアソームにつながる経路)にかかわるfactorを明らかにすることがpossibleになった. Cytoplasmic electrophoresis activity measurement system is based on two-dimensional electrophoresis and intracellular protein mobility determination system.また, GST fusion protein として, GATA-6 coliform に発appears させpurificationし, cytoplasm fractionation added によるtest tube protein decomposition system construction も行った. The cAMP treatment of このにより and ジブチリルcAMP can promote the cytoplasmic fractionation of cells and promote the decomposition of fusion proteins. The characteristics of the これらの线を Use the いて変different strainのcharacteristicsをANALYSISしつつ, and the これらの性の同定を进めることがpossibleになった.また, 一つの変differentiated cells, では, cAMP exists, しないときのプロテアソームactivity is low く, the early stage of なくとものねらいに along the った変化が変different strains に出きていることが明らかになった.