細胞板位置決定機構における痕跡物質の探索

タバコ培養細胞BY-2から細胞膜ゴーストを調製し、抗キシログルガン抗体を用いて蛍光染色を行ったところ、表層微小管、PPBにドット状の染色が見られた。この染色は、微小管破壊剤であるpropyzamideで細胞を前処理すると消失した。キシログルガン(XG)はゴルジ体で合成され小胞によって細胞表層に運搬されることが知られているので、これらの結果はゴルジ小胞が微小管に結合すること、したがって微小管が高密度に存在するPPBにはXGを含むゴルジ小胞が蓄積されていることを示す。そこで、ゴルジ小胞を単離し、その内容物に対する抗体を作製することで検討することを計画した。BY-2細胞をプロトプラスト化し、破砕、段階的遠心分離、密度勾配遠心などにより膜小胞分画を得た。ゴルジ小胞の特定はXG抗体によるドットブロット法で行った。その結果、微細構造的にほぼ均一と思われる膜小胞分画を得た。細胞膜ゴーストを用いた蛍光抗体染色および免疫電顕でXGを含む小胞が微小管に結合していることが示唆されていたので、BY-2細胞より微小管を調製して、単離膜小胞との結合を見た。その結果、一部の膜小胞が微小管に結合することがわかった。現在、ゴルジ小胞と思われる分画を抗原として抗体作製の準備中である。一方、痕跡の手がかりを微細構造学的に見出すために電子顕微鏡によるPPBの詳細な観察を試みた。方法は、細胞膜ゴーストの negative stainingと樹脂包埋による超薄切片法である。観察の確率を上げるために、キナーゼ阻害剤であるk252aを用いて細胞の同調化を行った。最高で約50%の細胞がPPBを持つ細胞集団が得られた。しかし、現在のところ特徴的な構造は観察されていない。フリーズエッチング、フリーズフラクチャー法などを導入する必要があるかもしれない。

タバコ培養細胞BY-2から細胞膜ゴーストを調製し、抗キシログルガン抗体を用いて蛍光染色を行ったところ、表層微小管、PPBにドット状の染色が見られた。この染色は、微小管破壊剤であるpropyzamideで細胞を前処理すると消失した。キシログルガン(XG)はゴルジ体で合成され小胞によって細胞表層に運搬されることが知られているので、これらの結果はゴルジ小胞が微小管に結合すること、したがって微小管が高密度に存在するPPBにはXGを含むゴルジ小胞が蓄積されていることを示す。そこで、ゴルジ小胞を単離し、その内容物に対する抗体を作製することで検討することを計画した。BY-2細胞をプロトプラスト化し、破砕、段階的遠心分離、密度勾配遠心などにより膜小胞分画を得た。ゴルジ小胞の特定はXG抗体によるドットブロット法で行った。その結果、微細構造的にほぼ均一と思われる膜小胞分画を得た。細胞膜ゴーストを用いた蛍光抗体染色および免疫電顕でXGを含む小胞が微小管に結合していることが示唆されていたので、BY-2細胞より微小管を調製して、単離膜小胞との結合を見た。その結果、一部の膜小胞が微小管に結合することがわかった。現在、ゴルジ小胞と思われる分画を抗原として抗体作製の準備中である。一方、痕跡の手がかりを微細構造学的に見出すために電子顕微鏡によるPPBの詳細な観察を試みた。方法は、細胞膜ゴーストの negative stainingと樹脂包埋による超薄切片法である。観察の確率を上げるために、キナーゼ阻害剤であるk252aを用いて細胞の同調化を行った。最高で約50%の細胞がPPBを持つ細胞集団が得られた。しかし、現在のところ特徴的な構造は観察されていない。フリーズエッチング、フリーズフラクチャー法などを導入する必要があるかもしれない。