両生類における初代細胞培養法および遺伝子ノックアウト細胞作成技術の構築

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1.初代培養細胞への外来遺伝子導入効率を解析するための道具として、サイトメガロウイルスIEプロモーター制御にGFP遣伝子を置いたブラスミドDNAと、オーガナイザーでの発現を制御する領域が特定されているツメガエルのgoosecoid遺伝子プロモーター制御下にGFP遺伝子を置いたブラスミドDNAを作成し、これを用いたトランスジェニックツメガエルを作成した。また、goosecoid遺伝子のプロモーター制御下にあるGFP遺伝子が染色体に組み込まれていることの確認をおこなった。2.発生の非常に早いステージ(初期原腸胚)でisthmus(中脳-後脳境界)特異的に発現するc-hairy遣伝子のゲノムライブラリーから異なろ長さのプロモーター領域を単離し、その下流にGFP遺伝子を置いたブラスミドDNAを作成したが、これらの塩基配列を決定したところ、どのクローンからもプローブとして用いたc-hairy cDNA断片の配列を確認できなかった。その後も同じライブラリーから独立に複数のクローンの単離を行なったが、目的の配列を含むものを得ることは出来なかったために、現在は再度ゲノムライブラリーの構築を行なっている。今後、これを用いてトランスジェニックツメガエルを作成し、単離したプロモーター領域がisthmus特異的発現に十分であることを確認した後、isthmus特異的発現制御に必要十分な領域を特定するためにプロモーター領域に欠失を導入してさらなる解析を行なう。3.X.tropicalisの試験官内受精から個体発生過程に至る条件の検討を行なった結果、培養温度以外の条件は基本的にX.laevisに等しいことを確認した。また、約4カ月で性的に成熟することを確認した。さらに、X.laevisのcDNAから作成した複数のプローブを用いてwhole-mount in situハイブリダイゼーションを行なったところ、基本的には互いにクロスハイブリダイズし得ることを見いだした。