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マツノザイセンチュウの病原因子の解明とその進化的起源の検証

松树线虫致病因子的阐明及其进化起源的验证

基本信息

批准号：
12J09215
负责人：
新屋良治
金额：
$ 5.45万
依托单位：
Chubu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度取得したゲノム情報をもとに、マツノザイセンチュウとその近縁種であるオキナワザイセンチュウ（Bursaphelenchus okinawaensis) を使ってトランスジェニック線虫の作製手法の開発に取り組んだ。オキナワザイセンチュウは雌雄同体（マツノザイセンチュウは雌雄異体）の種であることからトランスジェニックや遺伝子破壊株作製手法の開発を行なう上で有用な線虫種である。まず、複数のオキナワザイセンチュウプロモーター配列および3’UTR配列をGFPとともにプラスミドに組み込みトランスジェニック線虫作製用コンストラクトを作製した。マイクロインジェクション法を用いてトランスジェニック線虫の作製を試みたがマツノザイセンチュウやその近縁種では本手法により良い結果が得られなかった。次に、パーティクルガンを用いた手法を試した。本手法ではオキナワザイセンチュウにおいて比較的効率良くGFPを発現するトランスジェニック線虫を分離できるようになった。現在では世代を超えて効率良く導入遺伝子が受け継がれるように手法の最適化を行っている。さらに今年度はトランスジェニック線虫作製手法の開発と併せてCRISPR/Cas9法を用いた標的遺伝子破壊法の開発にも取り組んできた。まず取得したゲノム情報を下にC. elegansのdpy変異体の原因遺伝子のホモログ分子をオキナワザイセンチュウにおいて探索し、２つのdpy様遺伝子を標的とするsgRNAを作出した。このコンストラクトをCas9タンパク質をコードするmRNAさらには精製タンパク質と同時に線虫体内に導入することにより標的遺伝子破壊株の作出を試みている。現在までに目的変異体の取得には成功していないが、上記のトランスジェニック線虫作出手法の最適化と併せて条件の最適化を継続することにより近い将来に変異体の分離が行えると考えている。

Last year, we obtained the information of したゲノムをもとに, マツノザイセンチュウとそのNearly Bursaphelenchus okinawaensis) をmake the ってトランスジェニック nematode production technique の开発にtake the りgroup んだ.オキナワザイセンチュウはHermaphrodite The method of making the からトランスジェニックや缝子波壊 strain is the useful nematode species である.まず, plural のオキナワザイセンチュウプロモーターarray および3’UTR array をGFPとともにプラスミドに组み込みトランスジェニック nematode production and コンストラクトを production した.マイクロインジェクション法を用いてトランスジェニック nematode のproduction をtrialみたがマツノザイセンチュウやそのNearly縁kindではthis technique is a good result and the result is a good result. The next time, パーティクルガンを uses the いた technique to try した. The efficiency of this method is relatively good. Pを発成するトランスジェニック nematodesをseparationできるようになった. Nowadays, the generation of super-high efficiency has introduced the optimization method of the legacy of the legacy of the child.さらにThis year's はトランスジェニック nematode production technique の开発と和せてCRIS The PR/Cas9 method uses the original mark of the target and the method is used to open the method and take the group.まずGet information on したゲノムを下にC. elegansのdpy変variantのcausal legacy 伝子のホモログmolecule をオキナワザイセンチュウにおいてExplorationし, ２つのdpy様伝子をOBJECT とするsgRNAを做した.このコンストラクトをCas9 タンパクquality をコードするmRNA さらには refined タンパAt the same time, the nematode was introduced into the body of the nematode, and the remaining subtypes of the target were introduced into the nematode and the test was carried out. Now we have successfully achieved the success of the target variant, and the best method of making nematodes is recorded above. Adaptation and combination of conditions and conditions, optimization of conditions, optimization of conditions, and optimization of conditions and conditions.