マツノザイセンチュウの病原因子の解明とその進化的起源の検証

松树线虫致病因子的阐明及其进化起源的验证

基本信息

批准号：
12J09215
负责人：
新屋良治
金额：
$ 5.45万
依托单位：
Chubu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度取得したゲノム情報をもとに、マツノザイセンチュウとその近縁種であるオキナワザイセンチュウ（Bursaphelenchus okinawaensis) を使ってトランスジェニック線虫の作製手法の開発に取り組んだ。オキナワザイセンチュウは雌雄同体（マツノザイセンチュウは雌雄異体）の種であることからトランスジェニックや遺伝子破壊株作製手法の開発を行なう上で有用な線虫種である。まず、複数のオキナワザイセンチュウプロモーター配列および3’UTR配列をGFPとともにプラスミドに組み込みトランスジェニック線虫作製用コンストラクトを作製した。マイクロインジェクション法を用いてトランスジェニック線虫の作製を試みたがマツノザイセンチュウやその近縁種では本手法により良い結果が得られなかった。次に、パーティクルガンを用いた手法を試した。本手法ではオキナワザイセンチュウにおいて比較的効率良くGFPを発現するトランスジェニック線虫を分離できるようになった。現在では世代を超えて効率良く導入遺伝子が受け継がれるように手法の最適化を行っている。さらに今年度はトランスジェニック線虫作製手法の開発と併せてCRISPR/Cas9法を用いた標的遺伝子破壊法の開発にも取り組んできた。まず取得したゲノム情報を下にC. elegansのdpy変異体の原因遺伝子のホモログ分子をオキナワザイセンチュウにおいて探索し、２つのdpy様遺伝子を標的とするsgRNAを作出した。このコンストラクトをCas9タンパク質をコードするmRNAさらには精製タンパク質と同時に線虫体内に導入することにより標的遺伝子破壊株の作出を試みている。現在までに目的変異体の取得には成功していないが、上記のトランスジェニック線虫作出手法の最適化と併せて条件の最適化を継続することにより近い将来に変異体の分離が行えると考えている。

基于去年获得的基因组信息，我们致力于开发一种使用松树线虫及其近亲冲绳线虫（Bursapelenchus okinawaensis）创建转基因线虫的方法。由于日本蠕虫线虫是一种雌雄同体（松树线虫是外国英雄），因此它是用于开发用于产生转基因和基因破坏菌株的方法的有用线虫物种。首先，将多个糖线虫启动子序列和3'UTR序列与GFP集成到质粒中，以创建用于生产转基因线虫的构造。我们试图使用显微注射产生转基因线虫，但是该方法并不能为松树线虫及其相关物种提供良好的结果。接下来，我们尝试了使用粒子枪的方法。该方法已使在猴子线虫中相对有效地表达GFP的转基因线虫的分离。如今，该方法已进行了优化，以确保转基因有效地降落在世代上。此外，今年，我们一直在努力开发一种生产转基因线虫的方法，并使用CRISPR/CAS9方法开发目标基因破坏方法。首先，获得的基因组信息用于搜索线虫中秀丽隐杆线虫的dpy突变体基因的同源分子，并产生了靶向两个dpy样基因的SGRNA。该构建体正在与编码Cas9蛋白和纯化蛋白的mRNA同时引入线虫体，从而试图产生靶基因破坏菌株。尽管迄今为止尚未成功获得目标突变体，但我们认为，通过继续优化条件以及上述转基因线虫生产方法的优化，可以在不久的将来分离突变体。