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SUMO-1ホモログ出芽酵母SMT3の機能解析

SUMO-1同源物酿酒酵母SMT3的功能分析

基本信息

批准号：
00J09765
负责人：
高橋芳充
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

すべてのタンパクを大腸菌発現系より精製しさらに効率のよいin vitro系を開発したところ、Smt3のポリ化が検出された。そこでポリ化サイトの同定を試みた。Smt3のN末に3つ存在するコンセンサスサイト(K11,K15,K19)の3つのリジン残基を同時にアルギニン残基に変換したものを作製し大腸菌発現系によって精製した。この精製蛋白質を用いて反応を行なうとSmt3のポリ化がおこらなくなった。さらにK11,K15,K19それぞれの単独変異体を作ったところK15Rの変異では(K11R, K15R, K19R)同様、ポリ化がおこらなくなっていた。よって、主に15番目のリジン残基を介してポリ化が行なわれていることがわかった。Ull1のホモログであるNfi1はin vivoでの基質がわからないため、E3として証明できていなかったが、大腸菌より精製したタンパクを用いてin vitroでの活性を調べてみた。基質としてはUll1の基質であるCdc3を用いた。Cdc3のSmt3化はNfi1の量に依存して促進され、Ull1同様に、Nfi1もE3活性を有していることが明らかとなった。またNfi1やUbc9自身もSmt3によって修飾されていることがわかった。Ull1の制御機構のひとつとして局在の制御が考えられる。Ull1はM期になるとバッドネックに局在しセプチンをSmt3化する。このバッドネック局在はUll1のC末端440a.aを削ることによって失われ、核に蓄積した。それと同時にCdc3のSmt3化もみられなくなった。しかし、このC末端を削ったUll1(ΔC440)を大腸菌で発現させるとin vitro系でCdc3のSmt3化を促進した。よって新規のin vivoでのUll1の制御を解析できる変異体の同定に至った。

E. coli production system, purification, purificationそこでポリ化サイトの同定を试みた。Smt3 N-terminal 3 residues are present in the three residues (K11,K15,K19) and are simultaneously replaced by N-terminal 3 residues in the control of Escherichia coli development. This refined protein can be used in reverse osmosis and the purification of Smt3 can be achieved. K11,K15,K19 are different from each other. K15R is different from each other. K11R, K15R, K19R are different from each other. The 15-mer residues of the main gene were isolated from the 15-mer residues. Ull1's base material is in vivo, E3's base material is in vitro, and E3's base material is in vitro. The matrix is Ull1 and Ull3. Cdc3 and Smt3 are quantitatively dependent on Nfi1, Ull1, Nfi1 and E3. Nfi1 and Ubc9 own Smt3. Ull1's control mechanism is in the control mechanism. Ull1 is the first time in the history of the United States. This is the first time that a nuclear deposit has occurred at the C-terminal 440a.a of Ull1. The same time, Cdc3 and Smt3 change the color of the film. C-terminal Ull1 (ΔC440) was detected in vitro and promoted in Smt3. The new rules are in vivo, and Ull1's control is analyzed.