SUMO-1ホモログ出芽酵母SMT3の機能解析

SUMO-1同源物酿酒酵母SMT3的功能分析

• 批准号: 00J09765
• 负责人: 高橋 芳充
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J09765/
• 关键词: SUMO; ライゲース; コビキチン様タンパク; セプチン; 細胞質分裂; 翻訳後修飾

すべてのタンパクを大腸菌発現系より精製しさらに効率のよいin vitro系を開発したところ、Smt3のポリ化が検出された。そこでポリ化サイトの同定を試みた。Smt3のN末に3つ存在するコンセンサスサイト(K11,K15,K19)の3つのリジン残基を同時にアルギニン残基に変換したものを作製し大腸菌発現系によって精製した。この精製蛋白質を用いて反応を行なうとSmt3のポリ化がおこらなくなった。さらにK11,K15,K19それぞれの単独変異体を作ったところK15Rの変異では(K11R, K15R, K19R)同様、ポリ化がおこらなくなっていた。よって、主に15番目のリジン残基を介してポリ化が行なわれていることがわかった。Ull1のホモログであるNfi1はin vivoでの基質がわからないため、E3として証明できていなかったが、大腸菌より精製したタンパクを用いてin vitroでの活性を調べてみた。基質としてはUll1の基質であるCdc3を用いた。Cdc3のSmt3化はNfi1の量に依存して促進され、Ull1同様に、Nfi1もE3活性を有していることが明らかとなった。またNfi1やUbc9自身もSmt3によって修飾されていることがわかった。Ull1の制御機構のひとつとして局在の制御が考えられる。Ull1はM期になるとバッドネックに局在しセプチンをSmt3化する。このバッドネック局在はUll1のC末端440a.aを削ることによって失われ、核に蓄積した。それと同時にCdc3のSmt3化もみられなくなった。しかし、このC末端を削ったUll1(ΔC440)を大腸菌で発現させるとin vitro系でCdc3のSmt3化を促進した。よって新規のin vivoでのUll1の制御を解析できる変異体の同定に至った。

从大肠杆菌表达系统中纯化所有蛋白质，以开发出更有效的体外系统，并检测到SMT3的多态性。因此，我们试图识别一个多态化位点。在SMT3的N端的三个共识位点（K11，K15，K19）处的三个赖氨酸残基同时转化为精氨酸残基，并使用大肠杆菌表达系统纯化。当使用这种纯化的蛋白质进行反应时，停止了SMT3的多态化。此外，当我们创建K11，K15和K19的单个突变体时，多同化被停止了K15R突变（K11R，K15R，K19R）。因此，发现多发生主要是通过赖氨酸残基在第15位进行的。 NFI1是ULL1的同源物，无法证明它为E3，因为其底物在体内不知道，但是我们使用大肠杆菌纯化的蛋白质在体外研究了其活性。作为底物，使用了ull1的底物cdc3。根据NFI1的量促进了CDC3的SMT3ISTION，并且发现NFI1也具有E3活性，就像ULL1一样。还发现NFI1和UBC9本身也被SMT3修改。 ULL1的控制机制之一是定位控制。 ULL1在M期将其定位在不良脖子上，并将Septin变成SMT3。通过切断ull1的C端440A并积聚在细胞核中，颈部定位损失了。同时，不再可转换为SMT3。但是，当在大肠杆菌中表达带有C-末端的ULL1（ΔC440）时，在体外系统中促进了Cdc3的Smt3ization。这导致了能够分析体内ULL1调节的新型突变体的鉴定。

项目成果

Takahashi, Y. et al.: "Comparative Analysis of Yeast PIAS-type SUMO ligase in vivo and in vitro"Journal of Biochemistry. (印刷中). (2003)

Takahashi, Y. 等人：“酵母 PIAS 型 SUMO 连接酶体内和体外的比较分析”《生物化学杂志》（出版中）。