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遺伝子治療をめざした制限酵素の認識特異性の拡大

扩大基因治疗限制性内切酶的识别特异性

基本信息

批准号：
12019102
负责人：
喜多恵子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高発現組換え体大腸菌から精製した制限酵素EcoO109Iを、PEG4000を沈殿剤として用いてハンギングドロップ法で結晶化した。得られた結晶のX線回折データを収集した結果、3.3Åの分解能でデータが得られ、単結晶であることが明らかとなった。しかし異方性が認められたため、これ以上の分解能のデータは未だ得られていない。制限酵素EcoO109I溶液に、認識配列を含む13塩基対のオリゴヌクレオチドを添加して結晶化を行った結果、PEG4000を沈殿剤として用いたとき結晶が得られたが、結晶が小さかったためX線照射を行うことができなかった。また、修飾メチラーゼEcoO109Iの高発現組換え体大腸菌を構築して、酵素の精製を行った。電気泳動的にほぼ均一の酵素が得られ、これを用いて諸性質を明らかにした。メチル化塩基の特異性を解析した結果、認識配列PuGGNCCPyの内側のCをメチル化することを明らかにした。さらに、制限酵素遺伝子の上流に存在するORFから合成される蛋白質の機能解析を行った。制限酵素と上流ORFは、上流ORFのプロモーターの制御を受けpolycistronic mRNAとして合成され、上流ORF遺伝子産物は、自身のプロモーターの活性化を行うことで、制限酵素遺伝子の転写を調節する新規転写調節因子であること明らかにした。上流ORF遺伝子産物を部分精製して、DNA結合活性を調べた結果、翻訳開始点の上流76bpの領域に特異的に結合することを明らかにした。修飾メチラーゼのプロモーターは、このORF遺伝子産物による特異的な活性化は認められず、修飾メチラーゼは構成的に発現することが明らかとなった。

The high level of development of recombinant Escherichia coli, purification, restriction enzymes EcoO109I, PEG4000, and crystallization The X-ray reflection of the crystal is obtained by combining the results, 3.3%, and the decomposition energy is obtained by combining the X-ray reflection with the crystal. The above decomposition energy can be divided into two parts. EcoO109I solution, recognition and alignment, PEG4000 crystallization, X-ray irradiation, etc. The construction of E. coli and purification of enzymes were carried out by high expression group EcoO109I. The properties of electrokinetic enzymes are clearly defined. The results of the analysis of the specificity of the PuG CCPy and the understanding of the inner C of the PuG CCPy are clear. The functional analysis of protein in the upstream of restriction enzyme gene ORF synthesis Control enzymes and upstream ORFs, control of upstream ORFs, synthesis of polytronic mRNA, activation of upstream ORF gene products, regulation of upstream ORFs, new regulation factors The upstream ORF gene product was partially purified, DNA binding activity was modulated, and the upstream 76bp domain specific binding activity was determined. The ORF gene product is specifically activated to recognize the presence of the modified ORF gene.