遺伝子治療をめざした制限酵素の認識特異性の拡大

高発現組換え体大腸菌から精製した制限酵素EcoO109Iを、PEG4000を沈殿剤として用いてハンギングドロップ法で結晶化した。得られた結晶のX線回折データを収集した結果、3.3Åの分解能でデータが得られ、単結晶であることが明らかとなった。しかし異方性が認められたため、これ以上の分解能のデータは未だ得られていない。制限酵素EcoO109I溶液に、認識配列を含む13塩基対のオリゴヌクレオチドを添加して結晶化を行った結果、PEG4000を沈殿剤として用いたとき結晶が得られたが、結晶が小さかったためX線照射を行うことができなかった。また、修飾メチラーゼEcoO109Iの高発現組換え体大腸菌を構築して、酵素の精製を行った。電気泳動的にほぼ均一の酵素が得られ、これを用いて諸性質を明らかにした。メチル化塩基の特異性を解析した結果、認識配列PuGGNCCPyの内側のCをメチル化することを明らかにした。さらに、制限酵素遺伝子の上流に存在するORFから合成される蛋白質の機能解析を行った。制限酵素と上流ORFは、上流ORFのプロモーターの制御を受けpolycistronic mRNAとして合成され、上流ORF遺伝子産物は、自身のプロモーターの活性化を行うことで、制限酵素遺伝子の転写を調節する新規転写調節因子であること明らかにした。上流ORF遺伝子産物を部分精製して、DNA結合活性を調べた結果、翻訳開始点の上流76bpの領域に特異的に結合することを明らかにした。修飾メチラーゼのプロモーターは、このORF遺伝子産物による特異的な活性化は認められず、修飾メチラーゼは構成的に発現することが明らかとなった。

高発現組換え体大腸菌から精製した制限酵素EcoO109Iを、PEG4000を沈殿剤として用いてハンギングドロップ法で結晶化した。得られた結晶のX線回折データを収集した結果、3.3Åの分解能でデータが得られ、単結晶であることが明らかとなった。しかし異方性が認められたため、これ以上の分解能のデータは未だ得られていない。制限酵素EcoO109I溶液に、認識配列を含む13塩基対のオリゴヌクレオチドを添加して結晶化を行った結果、PEG4000を沈殿剤として用いたとき結晶が得られたが、結晶が小さかったためX線照射を行うことができなかった。また、修飾メチラーゼEcoO109Iの高発現組換え体大腸菌を構築して、酵素の精製を行った。電気泳動的にほぼ均一の酵素が得られ、これを用いて諸性質を明らかにした。メチル化塩基の特異性を解析した結果、認識配列PuGGNCCPyの内側のCをメチル化することを明らかにした。さらに、制限酵素遺伝子の上流に存在するORFから合成される蛋白質の機能解析を行った。制限酵素と上流ORFは、上流ORFのプロモーターの制御を受けpolycistronic mRNAとして合成され、上流ORF遺伝子産物は、自身のプロモーターの活性化を行うことで、制限酵素遺伝子の転写を調節する新規転写調節因子であること明らかにした。上流ORF遺伝子産物を部分精製して、DNA結合活性を調べた結果、翻訳開始点の上流76bpの領域に特異的に結合することを明らかにした。修飾メチラーゼのプロモーターは、このORF遺伝子産物による特異的な活性化は認められず、修飾メチラーゼは構成的に発現することが明らかとなった。