遺伝子治療をめざした制限酵素の認識特異性の拡大

扩大基因治疗限制性内切酶的识别特异性

• 批准号: 11132103
• 负责人: 喜多 恵子
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11132103/
• 关键词: 制限酵素; 修飾メチラーゼ; 高発現ベクター; 結晶化; 発現調節; 水平伝播; ミトコンドリア病; 遺伝子治療

大腸菌H709c株ゲノムDNAから、EcoO109I制限修飾酵素遺伝子をコードする9-kbのBamHI断片をクローニングした。このうちの3.2-kbのEcoT22I断片上に、制限修飾酵素遺伝子はクラスターを形成していた。制限修飾酵素遺伝子の周辺配列を解析した結果、P4ファージのインテグラーゼと溶菌サイクルに必須な遺伝子群が整列しており、大腸菌K-12株ゲノムの96分に存在するleuX遺伝子下流に、制限修飾酵素遺伝子を含む遺伝子群がインテグレートされたゲノム構造を持つことから、P4ファージの宿主菌株間でEcoO109Iシステムが水平伝播した可能性が示唆された。さらに、本菌株ではI型やメチル化DNA特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子が欠損しており,唯一の制限系としてEcoO109I-II型制限修飾システムを保持するという、大腸菌としては極めて特異なゲノム構造を持つことが明らかとなった。制限酵素を大量発現させるため、3.2-kbEcoT22I断片から2.7-kbのHpaI-EcoT22I断片を切り出し、pUC118のlacプロモーターの下流に挿入して、IPTG添加で誘導を行った結果、制限酵素の生産量は親株であるH709c株の約160倍に増加した。高発現組換え体大腸菌から、3種類のカラムクロマトグラフィーを用いて、制限酵素を電気泳動的に均一に精製した。ハンギングドロップ法を用いて結晶化条件を検討した結果、PEG 4000を沈殿剤として用いたとき、柱状結晶が生成した。また、高発現化の過程で、制限酵素遺伝子の上流に存在する0.3-kbのORFから合成される蛋白質が、制限酵素遺伝子の転写活性化に関与していることも明らかにした。

E. coli H709c strain requires DNA sequencing, EcoO109I restriction enzyme sequencing and 9-kb BamHI sequencing. The 3.2-kb EcoT22I fragment was formed on the restriction enzyme gene. Analysis of the circumferential alignment of the restriction modifier gene, P4 gene sequence, lysozyme sequence, and required subpopulation, 96 of E. coli K-12 strains were present, and leuX gene downstream, restriction modifier gene sequence, and required subpopulation structure were determined. EcoO109 is the most common type of host strain. In addition, this strain has the unique restriction system EcoO109I-II restriction modification to maintain the unique DNA structure of Escherichia coli. A large amount of restriction enzyme was produced in the first half of this year. The 3.2-kb EcoT 22 I fragment was cut out from the 2.7-kb HpaI-EcoT22I fragment. The downstream of pUC118 was introduced. IPTG was added to induce the production of restriction enzyme. The production of restriction enzyme increased by about 160 times compared with the parent strain H709c. High level of development of group E. coli, three types of bacteria, enzyme restriction, electrophoresis, uniform purification PEG4000 was crystallized under different crystallization conditions. The process of high expression, restriction enzyme gene upstream existence of 0.3-kb ORF synthesis, protein synthesis, restriction enzyme gene transcription activity related to the development of this disease.

项目成果

Keiko Kita: "Evidence of horizontal transfer of the EcoO109I restriction-modification gene to Escherichia coil chromosomal DNA"Journal of Bacteriology. 181(21). 6822-6827 (1999)

Keiko Kita：“EcoO109I 限制性修饰基因水平转移至大肠杆菌染色体 DNA 的证据”细菌学杂志。