遺伝子治療をめざした制限酵素の認識特異性の拡大

扩大基因治疗限制性内切酶的识别特异性

• 批准号: 10145109
• 负责人: 喜多 恵子
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10145109/
• 关键词: 遺伝子病; ミトコンドリアDNA; 制限酵素; 修飾メチラーゼ; P4ファージ; 溶原化

ヒトミトコンドリア遺伝子の点変異(A3243G)によって引き起こされる遺伝子病の治療を目的として、制限酵素EcoO109Iの認識配列の拡大を行うために、まず遺伝子のクローニングと構造解析を行った。大腸菌H709c株の菌体から、制限酵素EcoO109Iを部分精製し、N末端アミノ酸を20残基決定した。決定したアミノ酸配列を基にオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用い、大腸菌H709c株全DNAのサザンハイブリダイゼーション解析を行った。シグナルの得られた9kbのBamHI断片をクローニングして、3.1kbのEcoT22I断片の全塩基配列を解析した。制限酵素は816bpにコードされており、塩基配列から推定される分子量は31.4kDaであった。一方、修飾メチラーゼは1,248bpにコードされており、塩基配列から推定される分子量は45.7kDaで、両酵素遺伝子は36bpの間隔でtail-to-tailの方向で配置されており、各々の遺伝子の転写は異なるプロモーターによって制御されていることが示唆された。制限修飾酵素遺伝子をコードする領域をプラスミドベクターにサブクローニングして、大腸菌での発現を調べた結果、両酵素活性ともに検出された。修飾メチラーゼはGG(A/T)m5CCおよびGGNm5CCを認識する数種のメチラーゼと高い相同性を示したことから、修飾メチラーゼEcoO109Iは、RGGNm5CCYの特異性を示すことが示唆された。EcoO109I制限修飾酵素遺伝子周辺の塩基配列を解析した結果、大腸菌K12株染色体DNAの96.9min付近の配列とともに、P4ファージのintegraseならびにpsu遺伝子産物をコードする遺伝子と、極めて高い相同性を示す領域が見いだされた。このことは、本制限修飾系遺伝子の由来および進化を探る上で極めて興味深いものと考えられる。今後、大量発現系の構築、酵素の結晶化、立体構造の解析を行い、人工酵素の分子設計を行っていく予定である。

The aim of the treatment of genetic diseases is to limit the enzyme EcoO109I recognition sequence and to analyze the structure of genetic proteins. E. coli strain H709c was partially purified by restriction enzyme EcoO 109I and determined by 20 residues of N-terminal amino acid. To determine the sequence of DNA from Escherichia coli strain H709c The sequence analysis of the 9kb BamHI fragment and the 3.1 kb EcoT22I fragment was performed. The restriction enzyme has a molecular weight of 31.4 kDa at 816bp. The molecular weight of the protein was estimated to be 45.7 kDa, and the tail-to-tail orientation of the enzyme gene was 36bp apart. Restriction of enzyme activity in the field of cell culture, expression of E. coli, and detection of enzyme activity GG(A/T) m5CC and GGNm5CC are recognized as several types of EcoO 109I and RGGNm5CCY. EcoO109I restriction enzyme gene sequence analysis results, Escherichia coli K12 strain chromosome DNA 96.9 min close to the sequence, P4 protein integrase and psu gene products, the gene sequence, extremely high identity of the field is shown. The origin and evolution of this system are discussed in detail. In the future, the construction of a large number of development systems, the crystallization of enzymes, the analysis of three-dimensional structure, the molecular design of artificial enzymes, etc.