オオムギ染色体DNAライブラリーの構築とゲノム解析への利用

大麦染色体DNA文库的构建及其在基因组分析中的应用

基本信息

批准号：
12202036
负责人：
村田稔
金额：
--
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

オオムギは、ゲノムサイズが極めて大きいため、まだ充分な数のDNAマーカーがマップされておらず、ゲノム全体をカバーできるBAC、YACライブラリーもまだ完全には得られていない。また、ゲノム中に多量に存在する反復配列も、詳細な遺伝地図の作製を困難にしている。本研究ではそれ故、マイクロダイセクション法により、オオムギなどの特定染色体、腕、部位を切り取り、その領域特異的なDNAライブラリーを構築することを目的としている。現在まで、マイクロダイセクションにより切り取った単一の染色体から、そのDNAを増幅することに成功している。しかし、オオムギではその形態から染色体を同定することが困難なため、マイクロサテライトマーカなどによる判別を試みている。増幅したDNAの特異性を検定するために、FISH(蛍光in situハイブリダイゼイション)を行ったが、散在型反復配列が含まれているため、染色体の同定は困難であった。現在、原因となる反復配列の特定と、これら反復配列を増幅したDNAから除去する試みを行っている。コムギなどを用いたこれまでの解析から、増幅したDNA断片には、ESTや既知遺伝子のコーディング領域とホモロジーを示す配列がかなりの割合(〜40%)で含まれていることがわかった。そこで、これら遺伝子に相当するcDNAの直接選抜を試みた。プローブには、マイクロダイセクトした染色体からDOP-PCRで増幅したDNAを用い、これをビオチン化した。cDNAは、幼穂からポリA^+mRNAを抽出した後、SMART(クロンテック)により合成した。cDNAには、マイクロサテライトを含むものがあるため、ゲノミックDNAから調整したCot1 DNAをプレハイブリダイゼイションの段階で加えた。2回の直接選抜を行い、PCRを行ったところ、スメアの中に数本のバンドが観察された。

大麦的基因组大小非常大，因此尚未映射的DNA标记不足，并且可以覆盖整个基因组的BAC和YAC文库尚未完全获得。同样，基因组中大量存在的重复序列使得难以创建详细的遗传图。因此，这项研究的目的是通过显微解剖来切除特定的染色体，臂和位点，例如大麦，并构建特定区域的DNA文库。迄今为止，它已经从单个染色体中成功扩增了DNA，该染色体已被微分解切碎。但是，由于很难从大麦的形态中识别出染色体，因此我们试图使用微卫星标记等区分它们。为了测试扩增的DNA的特异性，进行了鱼（原位杂交荧光），但是由于存在分散的重复序列，因此很难鉴定染色体鉴定。当前，我们正在尝试识别因子重复序列，并从放大的DNA中删除这些重复序列。使用小麦和其他材料的先前分析表明，放大的DNA片段包含序列的显着比例（约40％），显示了EST和已知基因的编码区域和同源性。因此，我们尝试直接选择与这些基因相对应的cDNA。该探针是由DNA通过Microdi-Sed染色体和生物素化的DNA制成的。从幼体pupae中提取polya^+mRNA后，由Smart（Crontech）合成cDNA。一些cDNA包含微卫星，因此在杂交阶段中添加了从基因组DNA制备的COT1 DNA。进行了两次直接选择，并进行了PCR，并在涂片内观察到了几个频段。