DNA複製起点の単離と分子育種への応用

DNA复制起点的分离及其在分子育种中的应用

• 批准号: 20658003
• 负责人: 村田 稔
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20658003/
• 关键词: 複製起点; シロイヌナズナ; LoxP; ORC; GFP; 分子育種; イネ; DNA

本研究では、モデル植物であるシロイヌナズナやイネにおいて、核ゲノム中に散在する複製起点を単離、解析し、分子育種への応用を図ることを目的としている。そこで、シロイヌナズナからDNA複製起点を単離するため、ゲノム中に近接する2つのLoxP配列をもつ形質転換体の選抜を行った。シロイヌナズナでは、DNA型トランスポゾンDissociater (Ds)の両末端に挟まれたLoxP (Ds-LoxP-Ds)と、これとは独立のもう一つのLoxPをもつT-DNA形質転換系統が多数作出されている。これらの数系統を取り寄せ、Activator (Ac)由来のトランスポゼース(転移酵素)遺伝子発現個体と交配し、その後代を調べた。その結果、Ds-LoxP-Dsが転移し、ハイグロマイシン耐性を示す個体が複数確認された。さらに、これらとCreリコンビナーゼ遺伝子高温発現体とを交配し、次代を得た。現在、2つのLoxP間の組換えが高温で誘発されるか確認しているが、環状DNA分子の形成はまだ確認されていない。この方法では、最低2回の交配と1～2回の自殖を必要とするため、多くの労力と時間を必要とする。そこで今回、Ac転移酵素を発現している個体を直接形質転換した場合、自動的(連続的)に環状のDNA分子が形成できるT-DNAコンストラクトをデザインし、構築することに成功した。現在これを、各種培養細胞に導入し、その効率を調べている。また、シロイヌナズナの複製起点複合体ORC (Origin Recognition Complex)のサブユニット(ORCl～6)をコードするcDNAをすべてクローン化した。これらのcDNA配列から予測されるアミノ酸配列を元に、短いペプチドを合成し、抗体の作成を試みたが、特異的なものは得られなかった。AtORC4については、N末にGFPを融合させたコンストラクトを、シロイヌナズナの培養細胞に導入し核にシグナルを観察したが、今回はこれらコンストラクトの形質転換植物を作成した。現在、これらにおける特異性を確認している。

This study で は, モ デ ル plant で あ る シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ や イ ネ に お い て, nuclear ゲ ノ ム in に scattered す る copy starting point を 単 from, analytical し, molecular breeding へ の 応 with を 図 る こ と を purpose と し て い る. そ こ で, シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ か ら DNA replication starting point を 単 from す る た め, ゲ ノ ム に in nearly meet す る 2 つ の LoxP match column を も つ form quality planning in body の choose line sorting を っ た. シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で は, DNA ト ラ ン ス ポ ゾ ン Dissociater (Ds) の struck end に carry ま れ た LoxP (Ds - LoxP - Ds) と, こ れ と は independent の も う a つ の LoxP を も つ T - DNA form quality planning in system が most make さ れ て い る. こ れ ら の を take り send せ number system, the Activator (Ac) origin の ト ラ ン ス ポ ゼ ー ス moving enzyme (planning) heritage 伝 発 now individual と mating し, そ の offspring を adjustable べ た. そ の results, Ds - LoxP - Ds が planning move し, ハ イ グ ロ マ イ シ ン patience を す in individual が plural confirm さ れ た. さ ら に, こ れ ら と Cre リ コ ン ビ ナ ー ゼ posthumous son 伝 high-temperature 発 now body と を し mating, second generation を た. Now, 2 つ の LoxP の between groups in え が high-temperature で 発 lure さ れ る か confirm し て い る が, circular DNA molecules の formation は ま だ confirm さ れ て い な い. The <s:1> <s:1> method で とする, at least 2 rounds of <s:1> mating と1 to 2 rounds of <s:1> self-reproduction を necessary とするため, more く <s:1> labor force と time を necessary とする. そ こ で today back to Ac planning move and enzyme を 発 now し て い る individual を directly form quality planning in し た occasions, automatic (even 続) に annular が の DNA molecules formed で き る T - DNA コ ン ス ト ラ ク ト を デ ザ イ ン し, constructing す る こ と に successful し た. Now れを, various cultured cells に are introduced into <s:1>, そ <s:1> efficiency を adjustment べて べて る る る. ま た, シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の replication Complex ORC starting point (Origin Recognition Complex) の サ ブ ユ ニ ッ ト wouldn ~ 6) を コ ー ド す る cDNA を す べ て ク ロ ー ン change し た. こ れ ら の cDNA match column か ら be さ れ る ア ミ ノ acid with column を yuan に, short い ペ プ チ ド を synthetic し を test, antibody の み た が, specific な も の は have ら れ な か っ た. AtORC4 に つ い て は, at the end of the N に GFP fusion を さ せ た コ ン ス ト ラ ク ト を, シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の culture cell に import し nuclear に シ グ ナ ル を 観 examine し た が, today back to は こ れ ら コ ン ス ト ラ ク ト の form quality planning in plant を made し た. Now, て れらにおける specificity を confirms that て て る る.

项目成果

人工染色体 : 植物の染色体を作る ; 人工染色体研究の最前線

人工染色体：制造植物染色体；人工染色体研究的前沿；

• 发表时间: 2009
• 期刊: 生物の科学 遺伝 63
• 作者: Kuwano;M.;Mimura;T.;Takaiwa;F;Yoshida;K.T.;松原千枝・中島優典・吉田薫;岩井徹・高橋美智子・寺田靖子・吉田薫;石橋侑子・桑野美緒・吉田薫;中島優典・作山麻衣子・吉田薫;米野浩一・下川哲也・吉田薫;古賀亘・宮本正薫・吉田薫;桑野美緒・高岩文雄・吉田薫;桑野美緒・高岩文雄・吉田薫;村田稔・長岐清孝
• 通讯作者: 村田稔・長岐清孝