DNA複製起点の単離と分子育種への応用

DNA复制起点的分离及其在分子育种中的应用

• 批准号: 20658003
• 负责人: 村田 稔
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20658003/
• 关键词: 複製起点; シロイヌナズナ; LoxP; ORC; GFP; 分子育種; イネ; DNA

本研究では、モデル植物であるシロイヌナズナやイネにおいて、核ゲノム中に散在する複製起点を単離、解析し、分子育種への応用を図ることを目的としている。そこで、シロイヌナズナからDNA複製起点を単離するため、ゲノム中に近接する2つのLoxP配列をもつ形質転換体の選抜を行った。シロイヌナズナでは、DNA型トランスポゾンDissociater (Ds)の両末端に挟まれたLoxP (Ds-LoxP-Ds)と、これとは独立のもう一つのLoxPをもつT-DNA形質転換系統が多数作出されている。これらの数系統を取り寄せ、Activator (Ac)由来のトランスポゼース(転移酵素)遺伝子発現個体と交配し、その後代を調べた。その結果、Ds-LoxP-Dsが転移し、ハイグロマイシン耐性を示す個体が複数確認された。さらに、これらとCreリコンビナーゼ遺伝子高温発現体とを交配し、次代を得た。現在、2つのLoxP間の組換えが高温で誘発されるか確認しているが、環状DNA分子の形成はまだ確認されていない。この方法では、最低2回の交配と1～2回の自殖を必要とするため、多くの労力と時間を必要とする。そこで今回、Ac転移酵素を発現している個体を直接形質転換した場合、自動的(連続的)に環状のDNA分子が形成できるT-DNAコンストラクトをデザインし、構築することに成功した。現在これを、各種培養細胞に導入し、その効率を調べている。また、シロイヌナズナの複製起点複合体ORC (Origin Recognition Complex)のサブユニット(ORCl～6)をコードするcDNAをすべてクローン化した。これらのcDNA配列から予測されるアミノ酸配列を元に、短いペプチドを合成し、抗体の作成を試みたが、特異的なものは得られなかった。AtORC4については、N末にGFPを融合させたコンストラクトを、シロイヌナズナの培養細胞に導入し核にシグナルを観察したが、今回はこれらコンストラクトの形質転換植物を作成した。現在、これらにおける特異性を確認している。

The aim of this study is to isolate, analyze, and use the gene in molecular breeding of plants. The DNA replication origin is isolated from the genome, and the LoxP alignment is selected from the genome. DNA-type. The number system is selected, the Activator (Ac) is selected, and the offspring is selected. The results showed that Ds-LoxP-Ds were shifted, and Ds-LoxP-Ds showed that Ds-LoxP-Ds were tolerant. The first generation of high temperature organisms is the second generation of high temperature organisms. Now, the composition of 2 LoxP molecules is confirmed by high temperature induction, and the formation of circular DNA molecules is confirmed. This method is necessary for mating with the minimum of 2 cycles, for breeding with 1~2 cycles, and for mating with the minimum of 2 cycles, for breeding with the minimum of 1 ~ 2 cycles. In this case, the enzyme can be directly transformed into a DNA molecule, and the DNA molecule can be automatically formed into a DNA molecule. Now, all kinds of cultured cells are introduced, and the efficiency is adjusted. ORC (Origin Recognition Complex) is a cDNA fragment of ORCl~6. These cDNA sequences are predicted to be useful in the synthesis of antibodies. AtORC4 is a fusion protein that is introduced into cultured cells, and is now produced in plants with morphological changes. Now, the specificity is confirmed.

项目成果

人工染色体 : 植物の染色体を作る ; 人工染色体研究の最前線

人工染色体：制造植物染色体；人工染色体研究的前沿；

• 发表时间: 2009
• 期刊: 生物の科学 遺伝 63
• 作者: Kuwano;M.;Mimura;T.;Takaiwa;F;Yoshida;K.T.;松原千枝・中島優典・吉田薫;岩井徹・高橋美智子・寺田靖子・吉田薫;石橋侑子・桑野美緒・吉田薫;中島優典・作山麻衣子・吉田薫;米野浩一・下川哲也・吉田薫;古賀亘・宮本正薫・吉田薫;桑野美緒・高岩文雄・吉田薫;桑野美緒・高岩文雄・吉田薫;村田稔・長岐清孝
• 通讯作者: 村田稔・長岐清孝