DNA複製起点の単離と分子育種への応用

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本研究では、モデル植物であるシロイヌナズナやイネにおいて、核ゲノム中に散在する複製起点を単離、解析し、分子育種への応用を図ることを目的としている。そこで、シロイヌナズナからDNA複製起点を単離するため、ゲノム中に近接する2つのLoxP配列をもつ形質転換体の選抜を行った。シロイヌナズナでは、DNA型トランスポゾンDissociater (Ds)の両末端に挟まれたLoxP (Ds-LoxP-Ds)と、これとは独立のもう一つのLoxPをもつT-DNA形質転換系統が多数作出されている。これらの数系統を取り寄せ、Activator (Ac)由来のトランスポゼース(転移酵素)遺伝子発現個体と交配し、その後代を調べた。その結果、Ds-LoxP-Dsが転移し、ハイグロマイシン耐性を示す個体が複数確認された。さらに、これらとCreリコンビナーゼ遺伝子高温発現体とを交配し、次代を得た。現在、2つのLoxP間の組換えが高温で誘発されるか確認しているが、環状DNA分子の形成はまだ確認されていない。この方法では、最低2回の交配と1～2回の自殖を必要とするため、多くの労力と時間を必要とする。そこで今回、Ac転移酵素を発現している個体を直接形質転換した場合、自動的(連続的)に環状のDNA分子が形成できるT-DNAコンストラクトをデザインし、構築することに成功した。現在これを、各種培養細胞に導入し、その効率を調べている。また、シロイヌナズナの複製起点複合体ORC (Origin Recognition Complex)のサブユニット(ORCl～6)をコードするcDNAをすべてクローン化した。これらのcDNA配列から予測されるアミノ酸配列を元に、短いペプチドを合成し、抗体の作成を試みたが、特異的なものは得られなかった。AtORC4については、N末にGFPを融合させたコンストラクトを、シロイヌナズナの培養細胞に導入し核にシグナルを観察したが、今回はこれらコンストラクトの形質転換植物を作成した。現在、これらにおける特異性を確認している。