染色体複製開始に関わる核キナーゼ活性の時間空間的な制御機構の解析

真核生物染色体複製開始はCdc7-ASKキナーゼによって制御されると考えられている。Cdc7のキナーゼ活性は制御サブユニットであるASKがCdc7に結合することによってはじめて活性化される。また細胞周期を通してCdc7蛋白質の発現量は一定であるのに対し、ASK蛋白質の発現量がG1後期からS期を通じて上昇する。細胞への一過性の発現系においてCdc7のキナーゼ活性はASKと共発現している限り保持されており、その活性はCdc7抗体免疫沈降複合体のin vitro kinase activity及び、in vivoでの内在性のMCM2蛋白質をリン酸化する活性の両者によって評価できる。我々はASK分子のCdc7結合および活性化に必要な領域を同定し、Cdc7活性化分子として約170アミノ酸からなる領域にASK分子を最小化した。この領域にはASK/Dbf4ファミリーに保存されるmotif Mおよびmotif Cが含まれる。さらに、motif CのZn finger領域近傍の保存されたアミノ酸の置換により、Cdc7には結合するが、全く活性化しない変異分子を作製した。さらに、これらの分子の挙動を可視化して時間空間的に解析するために、CFPあるいはYFP融合蛋白質を作製した。野生型のCFP-ASK,YFP-Cdc7あるいはCFP-Cdc7,YFP-ASKは同一細胞に発現した場合、局在を一にする。現在、IRESを含むレトロウイルスベクターを用いて、Cdc7およびASK(野生型および変異型)を同時に発現した細胞を作製し、細胞周期や染色体複製反応における両蛋白質の挙動を検討中である。

真核生物染色体複製開始はCdc7-ASKキナーゼによって制御されると考えられている。Cdc7のキナーゼ活性は制御サブユニットであるASKがCdc7に結合することによってはじめて活性化される。また細胞周期を通してCdc7蛋白質の発現量は一定であるのに対し、ASK蛋白質の発現量がG1後期からS期を通じて上昇する。細胞への一過性の発現系においてCdc7のキナーゼ活性はASKと共発現している限り保持されており、その活性はCdc7抗体免疫沈降複合体のin vitro kinase activity及び、in vivoでの内在性のMCM2蛋白質をリン酸化する活性の両者によって評価できる。我々はASK分子のCdc7結合および活性化に必要な領域を同定し、Cdc7活性化分子として約170アミノ酸からなる領域にASK分子を最小化した。この領域にはASK/Dbf4ファミリーに保存されるmotif Mおよびmotif Cが含まれる。さらに、motif CのZn finger領域近傍の保存されたアミノ酸の置換により、Cdc7には結合するが、全く活性化しない変異分子を作製した。さらに、これらの分子の挙動を可視化して時間空間的に解析するために、CFPあるいはYFP融合蛋白質を作製した。野生型のCFP-ASK,YFP-Cdc7あるいはCFP-Cdc7,YFP-ASKは同一細胞に発現した場合、局在を一にする。現在、IRESを含むレトロウイルスベクターを用いて、Cdc7およびASK(野生型および変異型)を同時に発現した細胞を作製し、細胞周期や染色体複製反応における両蛋白質の挙動を検討中である。