ウシ肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼの精製およびその分子生物学的研究

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本研究では、ウシの肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(HLDase)(ヒスチジン合成酵素)を精製して性質を明らかにし、HLDaseのアミノ酸配列を決定し、さらにその塩基配列からオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてウシ肝臓のcDNAライブラリーからHLDase遺伝子をスクリーニングして、HLDase遺伝子の塩基配列を決定することを目的とした。本研究は、平成13年度に採択されたが、外国人特別研究員の都合により、平成13年10月23日から開始した。平成13年度は、ウシ肝臓のHLDaseの精製の第1段階として、粗酵素液の硫安分画により活性を示すタンパク質画分を分画する予定であったが、この第1段階で、他の酵素とは異なり、硫安分画をすると活性が現れなくなることがわかり、まず、その原因を究明した。原因は、硫酸アンモニウムの存在により、高速液体クロマトグラフィーで分析した場合にヒスチジンのピークが消失することであった。硫安分画に代わる有効な手段として、プロタミンとポリエチレングリコール(PEG)を用いることよりHLDase活性を示すタンパク質画分を分画することができた。すなわち、1%硫酸プロタミンを加えて遠心後の上清液に7-18%PEG沈殿画分を集めた。この処理により、HLDaseの比活性は3.2倍になった。また、この酵素は、-80℃に1週間保存すると約15%だけ活性が低下した。L-ヒスチジノールに対するこの酵素のKmおよびVmaxは1.43および0.23mMであった。また、NAD^+に対しては、1.0および0.72mMであった。この酵素活性は、Mn^<2+>により84%だけ活性が高まった。0.5mM Hg^<2+>は、この酵素活性を完全に阻害した。次に、7-18%PEG沈殿画分のNative PAGEを行った結果、HLDase活性を示すバンドが2本現れた。まもなく精製が終了する。