ウシ肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼの精製およびその分子生物学的研究

牛肝组氨醇脱氢酶的纯化及其分子生物学研究

• 批准号: 01F00320
• 负责人: 小野寺 良次
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01F00320/
• 关键词: 牛の肝臓; ヒスチジノールデヒドロゲナーゼの精製; プロタミン+ポリエチレングリコール; Native PAGE; 阻害剤; 活性化因子; Km; Vmax

本研究では、ウシの肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(HLDase)(ヒスチジン合成酵素)を精製して性質を明らかにし、HLDaseのアミノ酸配列を決定し、さらにその塩基配列からオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてウシ肝臓のcDNAライブラリーからHLDase遺伝子をスクリーニングして、HLDase遺伝子の塩基配列を決定することを目的とした。本研究は、平成13年度に採択されたが、外国人特別研究員の都合により、平成13年10月23日から開始した。平成13年度は、ウシ肝臓のHLDaseの精製の第1段階として、粗酵素液の硫安分画により活性を示すタンパク質画分を分画する予定であったが、この第1段階で、他の酵素とは異なり、硫安分画をすると活性が現れなくなることがわかり、まず、その原因を究明した。原因は、硫酸アンモニウムの存在により、高速液体クロマトグラフィーで分析した場合にヒスチジンのピークが消失することであった。硫安分画に代わる有効な手段として、プロタミンとポリエチレングリコール(PEG)を用いることよりHLDase活性を示すタンパク質画分を分画することができた。すなわち、1%硫酸プロタミンを加えて遠心後の上清液に7-18%PEG沈殿画分を集めた。この処理により、HLDaseの比活性は3.2倍になった。また、この酵素は、-80℃に1週間保存すると約15%だけ活性が低下した。L-ヒスチジノールに対するこの酵素のKmおよびVmaxは1.43および0.23mMであった。また、NAD^+に対しては、1.0および0.72mMであった。この酵素活性は、Mn^<2+>により84%だけ活性が高まった。0.5mM Hg^<2+>は、この酵素活性を完全に阻害した。次に、7-18%PEG沈殿画分のNative PAGEを行った結果、HLDase活性を示すバンドが2本現れた。まもなく精製が終了する。

This study で は, ウ シ の is crucial liver の ヒ ス チ ジ ノ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ (HLDase) (ヒ ス チ ジ ン synthetic enzyme) を refined し て nature を Ming ら か に し, HLDase の ア ミ ノ acid with を decided し, さ ら に そ の salt base with column か ら オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を synthetic し, こ れ を プ ロ ー ブ と し て ウ シ routine liver の cD NA ラ イ ブ ラ リ ー か ら HLDase posthumous son 伝 を ス ク リ ー ニ ン グ し て, HLDase but 伝 の salt base with column を decided す る こ と を purpose と し た. This study was conducted in the following years: に in the heisei 13 fiscal year, 択されたが by the foreign special researcher, によ by に, and began on October 23, heisei 13, ら by ら. は, pp.47-53 13 ウ シ routine liver の HLDase の refined の paragraph 1 order と し て, crude enzyme liquid sulfur content の に よ を り activity in す タ ン パ ク quality paint points を す る designated で あ っ た が, こ の で, paragraph 1 he の enzyme と は different な り, sulfur content を す る と active が now れ な く な る こ と が わ か り, ま ず, そ を の reasons in Ming Youdaoplaceholder0 た. Reason は, acid ア ン モ ニ ウ ム の is に よ り, high-speed liquid ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で analysis し た occasions に ヒ ス チ ジ ン の ピ ー ク が disappear す る こ と で あ っ た. Sulfur content generation painting に わ る have sharper な means と し て, プ ロ タ ミ ン と ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル (PEG) を い る こ と よ り を HLDase activity in す タ ン パ ク quality paint points を す る こ と が で き た. Youdaoplaceholder0, 1% sulfuric acid プロタ, プロタ を を after adding えて, the supernatant of the <s:1> に, 7-18%PEG. Shen dianhua is divided into を sets めた. <s:1> <s:1> treatment によ によ, HLDase <s:1> specific activity によ 3.2 times になった. Youdaoplaceholder0, <s:1> cultural enzyme に, stored at -80℃に for one week すると approximately 15%だけ activity が is low た た た. L-ヒスチジノ ヒスチジノ に に に against する する <s:1> enzyme <s:1> KmおよびVmax 1.43および0.23mMであった. Youdaoplaceholder0, NAD^+に against て に, 1.0および0.72mMであった. The activity of the <s:1> enzyme によ, Mn^<2+>によ <s:1> 84%だけ activity が high まった. 0.5 mMHg ^<2+> を, the activity of <s:1> hominase を completely に inhibits た. The results of に, 7-18%PEG Shen dian-plot <s:1> Native PAGEを rows った, HLDase activity を showed すバ ドが ドが ドが in two batches れた. Youdaoplaceholder0 ま なく refined が finished する.

项目成果

R.Onodera: "Essentiality of histidine in ruminant and other animals including human beings"Asian-Australasian Journal of Animal Science. 15. 455-454 (2003)

R.Onodera：“反刍动物和包括人类在内的其他动物中组氨酸的本质”《亚洲-澳大利亚动物科学杂志》。

Shaila Wadud, R.Onodera +2: "Studies on the possibility of histidine biosynthesis from histidinol, imidazolepyruvic acid, imidazoleacetic acid, and imidazolelactic acid by mixed ruminal bacteria, protozoa and their mixture in vitro"Applied Microbiology an

Shaila Wadud，R.Onodera 2：“混合瘤胃细菌、原生动物及其混合物体外从组氨醇、咪唑丙酮酸、咪唑乙酸和咪唑乳酸生物合成组氨酸的可能性的研究”应用微生物学和

Shaila Wadud, R.Onodera +1: "Method for determination of histidine in tissues by isocratic high-performance liquid chromatography and its application to the measurement of histidinol dehydrogenase activity in six cattle organs"Journal of Chromatography B.

Shaila Wadud，R.Onodera 1：“等度高效液相色谱法测定组织中组氨酸的方法及其在测定牛六个器官中组氨醇脱氢酶活性中的应用”Journal of Chromatography B.

Shaila Wadud, R.Onodera +1: "Synthesis of histidine in liver and kidney of cattle and swine"Animal Science Journal. 72. 253-256 (2001)

Shaila Wadud，R.Onodera 1：“牛和猪肝脏和肾脏中组氨酸的合成”动物科学杂志。

石橋晃 監修: "新編「動物栄養試験法」"養賢堂. 642 (2003)

石桥彰监督：“新版：动物营养测试方法”Yokendo 642 (2003)。