単頭プロセッシブ・ミオシンの探索とその運動メカニズムの解明

寻找单头进行性肌球蛋白并阐明其运动机制

• 批准号: 01J07975
• 负责人: 佐々木 直哉
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J07975/
• 关键词: モータータンパク質; 一分子力学計測; 化学力学共役; Unconventional Myosion; Unconventionl Myosin

単頭プロセッシブミオシンの運動メカニズムを解明するためには、その化学力学共役機構を明らかにする必要があり、そのためには一分子レベルでの力発生を反応速度論的に観測しなけばならない。このための手法としてはCaged ATPを用いた実験系が最も有効である。Caged ATPは紫外線によって急速にATPへと分解されるので、顕微鏡下では紫外線照射直後にATP濃度が急峻に上昇する。紫外線照射直後のモータータンパク質の力発生を観測することで、力発生を反応速度論的に議論することが可能となる。そこで、双頭ながら連続運動することが既知であるミオシンVを用いて、Caged ATPを用いた運動観測系を確立した。連続運動中のミオシンVは36nm毎のステップをすること、そのステップがいくつかのサブステップから成る可能性が示唆されている。こうしたミオシンVの連続運動中のステップとATP加水分解サイクルとの共役機構は未だ不明だが、Caged ATPを用いることでこの関係を明らかにできる。実験ではヒヨコ脳ミオシンVを直径0.2μmのビーズに結合し、光ピンセットを用いてこのビーズを捕捉した。このビーズをガラス基板上に固定したアクチン繊維に結合させた後、Caged ATP存在下で紫外線を照射したところ、ビーズが運動した。ビーズの中心の位置は斜光照明法で測定し、単一ミオシンV分子の運動を高時間空間分解能で検出した。その結果、ミオシンVの力発生はATPの結合直後に起こることが明らかになった。また、最初のステップのサイズは明らかに36nmより短く、それらの短いステップが36nmステップ内在のサブステップである可能性も示唆された。単頭プロセッシブミオシンとして既知であるミオシンIXはヒト白血病培養細胞HL60から精製できる。現在、大量培養したHL60よりミオシンIXを精製し、上記実験系を用いた計測を試みている。

単 head プ ロ セ ッ シ ブ ミ オ シ ン の movement メ カ ニ ズ ム を interpret す る た め に は, そ の chemical mechanics were existing institutions を Ming ら か に す る necessary が あ り, そ の た め に は a molecular レ ベ ル で の force born 発 を anti 応 speed theory に 観 measuring し な け ば な ら な い. The <s:1> ため ため technique と て て と Caged ATPを using the <s:1> た experiment is が most effective である. Caged ATP は ultraviolet に よ っ て rapid に ATP へ と decomposition さ れ る の で, 顕 microscopically で は に ATP concentration after ultraviolet irradiation straight が strict に growth in す る. After ultraviolet irradiation straight の モ ー タ ー タ ン パ ク qualitative の force born 発 を 観 measuring す る こ と で, force 発 を anti 応 speed theory talk に す る こ と が may と な る. そ こ で, double head な が ら even 続 movement す る こ と が already know で あ る ミ オ シ ン V を with い て, Caged ATP を い 観 た movement measurement system を establish し た. Even 続 movement の ミ オ シ ン V は 36 nm in their の ス テ ッ プ を す る こ と, そ の ス テ ッ プ が い く つ か の サ ブ ス テ ッ プ か ら possibility into る が in stopping さ れ て い る. こ う し た ミ オ シ ン V の even 続 movement の ス テ ッ プ と ATP hydrolysis サ イ ク ル と の は battle is not total だ unknown だ が, Caged ATP を い る こ と で こ の masato を and Ming ら か に で き る. Be 験 で は ヒ ヨ コ 脳 ミ オ シ を ン V 0.2 microns in diameter の ビ ー ズ に し, light ピ ン セ ッ ト を with い て こ の ビ ー ズ を capture し た. こ の ビ ー ズ を ガ ラ ス substrate に fixed し た ア ク チ ン 繊 d に combining さ せ た, Caged in the presence of ATP after で を exposure to the sun's ultraviolet rays し た と こ ろ, ビ ー ズ が movement し た. Youdaoplaceholder0 ビ ズ <s:1> the center <e:1> position of the <s:1> is determined by the <s:1> oblique light illumination method で, and the <s:1> and 単 - <s:1> シ シ シ シ <s:1> molecular <s:1> motion of V molecules を を high time and space decomposition can で検 obtain た た. The そ そ result, the <s:1> シ シ <e:1> <s:1> V nucleus force is generated by the <s:1> ATP nucleus, and after the direct combination, it is に and <s:1> る とが とが bright ら る になった になった. ま た, initially の ス テ ッ プ の サ イ ズ は Ming ら か に 36 nm よ り short く, そ れ ら の short い ス テ ッ プ が 36 nm ス テ ッ プ inner の サ ブ ス テ ッ プ で あ も る possibility in stopping さ れ た. 単 head プ ロ セ ッ シ ブ ミ オ シ ン と し て already know で あ る ミ オ シ ン IX は ヒ ト leukemia cultured cells HL60 か ら refined で き る. Now, a lot of training し た HL60 よ り ミ オ シ ン IX を refined し, written be を 験 department with い た measuring を try み て い る.

项目成果

Naoya Sasaki, Reiko Ohkura, Kazuo Sutoh: "Dictyostelium MyosinII Mutations That Uncouple the Converter Swing and ATP Hydrolysis Cycle"Biochemistry. 14巻・42号. 90-95 (2003)

Naoya Sasaki、Reiko Ohkura、Kazuo Sutoh：“盘基网柄菌肌球蛋白 II 突变使转化器摆动和 ATP 水解循环脱钩”《生物化学》第 14 卷，第 42 期。90-95 (2003)