偏性嫌気性細菌由来のリジン脱炭酸酵素の高次構造及び活性発現調節機構の解明

专性厌氧菌赖氨酸脱羧酶的高级结构和活性调节机制的阐明

基本信息

批准号：
01J08017
负责人：
高塚由美子
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

グラム陰性の偏性嫌気性細菌Selenomonas ruminantiumのべプチドグリカンに共有詰合したポリアミンの一種、カダベリンは、細胞分裂に必須の構成成分である。本菌のカダベリンを合成するリジン脱炭酸酵素(LDC)はオルニチンも認識し、一次構造はオルニチンに特異的な真核生物のオルニチン脱炭酸酵素(ODC)と高い相同性を持つ。一方で、本酵素は生育の定常期初期に急激に分解される厳密な発現親節を受けている。本研究は、本酵素の構造と基質認識機構との相関の分子レベルでの解明、および分解制御機構の解明を目的にしており、今年度までに以下の成果を得た。1.本酵素と真核生物ODCとの比較から、基質認識に関与すると推定した活性中心周辺の5アミノ酸残基に変異を導入し、オルニチンに対する特異性が70倍に高まったLDC変異酵素の作製に成功した。現在、大腸菌で大量発現させた組換え体LDCを用いて結晶化のスクリーニングを続行中である。2.本菌の細胞質画分を用いた本酵素のin vitro分解活性測定系を確立し、LDCの分解にATP要求性プロテアーゼが関与すること、本プロテアーゼは活性にMgイオンおよびジチオスレイトールを要求し、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSFにより阻害を受けることを解明した。3.本菌の細胞質画分中にLDCと親和性を持つ22kDaおよび25kDaのタンパク質を見出し、このうち22-kDaタンパク質(P22)がLDCの分解を促進する分解促進因子であること、また遺伝子解析からグラム陽性菌のリボソームタンパク質L10と高い相同性を有すること、プトレシンにより誘導を受けLDCと、ほぼ同時期に分解消失すること、菌体内存在量はLDCの1/10-1/2であることを解明した。LDCに対するP22の解離定数は8.5μMであった。現在、動物細胞ODCの分解制御因子であるアンチザイムとの関連性を検討しながら、P22とLDC分解制御機構について解析を進めている。

尸体是一种共价为革兰氏阴性浓度的厌氧菌细菌硒蛋白酶硒抗菌的多胺类型的多胺类，是细胞分裂的重要组成部分。合成该细菌的尸体的赖氨酸脱羧酶（LDC）也识别鸟氨酸，其主要结构与真核真核生物的鸟氨酸脱羧酶（ODC）高度同源。另一方面，这种酶经历了严格的表达父段，这些酶在生长的早期阶段迅速降解。这项研究旨在阐明该酶的结构与分子水平的底物识别机制之间的相关性，并阐明降解控制机制，到本财政年度，获得了以下结果。 1。将该酶与真核ODC进行比较表明，在活性中心周围的五个氨基酸残基引入了突变，估计该突变与底物识别有关，并成功产生了LDC突变酶，从而将其对Ornithine的特异性增加了70倍。目前，使用重组的LDC在大肠杆菌中大量表达结晶的筛查。 2。我们建立了一个系统，用于使用该细菌的胞质分数来测量该酶的体外降解活性，并发现ATP需要的蛋白酶与LDCS降解有关，并且该蛋白酶需要MG离子和Dithiothiothreitol的活性，并通过其活性来抑制蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白。 3. We found 22 kDa and 25 kDa proteins with affinity with LDCs in the cytoplasmic fraction of this bacteria, and revealed that the 22-kDa protein (P22) is a degradation-promoting factor that promotes LDC degradation, and that genetic analysis revealed that it has high homology with the ribosomal protein L10 of Gram-positive bacteria, that it was induced by腐烂并在与LDC的同时失去了分离，细菌的丰度为LDC的1/10-1/2。 LDC的p22解离常数为8.5μm。当前，我们正在研究与抗卵形（动物细胞ODC的降解调节剂）的关系时，正在对P22和LDC降解控制机制进行分析。