偏性嫌気性細菌由来のリジン脱炭酸酵素の高次構造及び活性発現調節機構の解明

专性厌氧菌赖氨酸脱羧酶的高级结构和活性调节机制的阐明

• 批准号: 01J08017
• 负责人: 高塚 由美子
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J08017/
• 关键词: Selenomonas ruminantium; リジン脱炭酸酵素; オルニチン脱炭酸酵素; ATP依存性プロテアーゼ; 分量制御因子; リボソームタンパク質; アンチザイム; 分解制御因子

グラム陰性の偏性嫌気性細菌Selenomonas ruminantiumのべプチドグリカンに共有詰合したポリアミンの一種、カダベリンは、細胞分裂に必須の構成成分である。本菌のカダベリンを合成するリジン脱炭酸酵素(LDC)はオルニチンも認識し、一次構造はオルニチンに特異的な真核生物のオルニチン脱炭酸酵素(ODC)と高い相同性を持つ。一方で、本酵素は生育の定常期初期に急激に分解される厳密な発現親節を受けている。本研究は、本酵素の構造と基質認識機構との相関の分子レベルでの解明、および分解制御機構の解明を目的にしており、今年度までに以下の成果を得た。1.本酵素と真核生物ODCとの比較から、基質認識に関与すると推定した活性中心周辺の5アミノ酸残基に変異を導入し、オルニチンに対する特異性が70倍に高まったLDC変異酵素の作製に成功した。現在、大腸菌で大量発現させた組換え体LDCを用いて結晶化のスクリーニングを続行中である。2.本菌の細胞質画分を用いた本酵素のin vitro分解活性測定系を確立し、LDCの分解にATP要求性プロテアーゼが関与すること、本プロテアーゼは活性にMgイオンおよびジチオスレイトールを要求し、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSFにより阻害を受けることを解明した。3.本菌の細胞質画分中にLDCと親和性を持つ22kDaおよび25kDaのタンパク質を見出し、このうち22-kDaタンパク質(P22)がLDCの分解を促進する分解促進因子であること、また遺伝子解析からグラム陽性菌のリボソームタンパク質L10と高い相同性を有すること、プトレシンにより誘導を受けLDCと、ほぼ同時期に分解消失すること、菌体内存在量はLDCの1/10-1/2であることを解明した。LDCに対するP22の解離定数は8.5μMであった。現在、動物細胞ODCの分解制御因子であるアンチザイムとの関連性を検討しながら、P22とLDC分解制御機構について解析を進めている。

グ ラ ム negative の biased too 気 bacterial Selenomonas ruminantium の べ プ チ ド グ リ カ ン に common wall or し た ポ リ ア ミ ン の a, カ ダ ベ リ ン は, the composition of cell division に must の で あ る. This bacterium の カ ダ ベ リ ン を synthetic す る リ ジ ン decarburization acid enzyme (LDC) は オ ル ニ チ ン も し, a tectonic は オ ル ニ チ ン に specific な eukaryotes の オ ル ニ チ ン decarburization acid enzyme (ODC) と high い identity を つ. One party で, in the early stage of the <s:1> homeostatic period of this enzyme る, に rapidly activates に decomposition される厳 densification な, resulting in the occurrence of parent segments を being けて る る る. の は this study, the enzyme structure と matrix know institutions と の phase masato の molecular レ ベ ル で の uttered, お よ び decomposition system royal institution の interpret を purpose に し て お り, our ま で に の results under を た. 1. This enzyme と eukaryotes ODC と の is か ら, matrix に masato and す る と presumption し た active center weeks 辺 の 5 ア ミ ノ acid residues に - different を import し, オ ル ニ チ ン に す seaborne high ま る specificity 70 times が に っ た LDC - isoenzymes の cropping に successful し た. Now, coliform で large 発 now さ せ た group in LDC え body を with い て crystallization の ス ク リ ー ニ ン グ を 続 line で あ る. 2. The cytoplasm of this bacterium is divided into を and た with this enzyme in Vitro decomposition activity determination を established し, LDC の decomposition に ATP request sex プ ロ テ ア ー ゼ が masato and す る こ と, this プ ロ テ ア ー ゼ は active に Mg イ オ ン お よ び ジ チ オ ス レ イ ト ー ル を し, セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ resistance against tonic PMSF に よ り resistance against を by け る こ と を interpret し た. 3. This bacterium の cytoplasm draw points に LDC と affinity を hold つ 22 kDa お よ び 25 kDa の タ ン パ ク qualitative を see し, こ の う ち 22 - kDa タ ン パ ク mass (P22) が LDC の decomposition を promote す る factoring promote で あ る こ と, ま た heritage 伝 son parsing か ら グ ラ ム positive の リ ボ ソ ー ム タ ン パ ク qualitative L10 と High い phase gay を す る こ と, プ ト レ シ ン に よ り induced を by け LDC と, ほ ぼ with に breaking down す る こ と, bacteria in the body content は LDC の 1/10-1/2 で あ る こ と を interpret し た. The <s:1> dissociation definite number of LDCに for するP22 is に 8.5μMであった. Now, animal cells ODC の factoring suppression で あ る ア ン チ ザ イ ム と の masato even sex を beg し 検 な が ら, P22 と LDC decomposition system royal institution に つ い て parsing を into め て い る.

项目成果

小野寺良次監修 板橋久雄編: "新ルーメンの世界"社団法人 農山漁村文化協会(2003年4月発行予定).

板桥尚雄主编、小野寺良二监修：《新流明的世界》农村文化协会（预定2003年4月出版）。

Yumiko Takatsuka, Yoshiyuki Kamio: "Molecular dissection of the Selenomonas ruminantium cell envelope and lysine decarboxylase involved in the biosynthesis of a polyamine covalently linked to the cell wall peptidoglycan layer"Bioscience, Biotechnology, an

Yumiko Takatsuka、Yoshiyuki Kamio：“反刍月藻细胞包膜的分子解剖和赖氨酸脱羧酶参与与细胞壁肽聚糖层共价连接的多胺的生物合成”生物科学、生物技术、

Yoshihiro Yamaguchi, Yumiko Takatsuka, Yoshiyuki Kamio: "Identification of a 22-kDa protein required for the degradation of Selenomonas ruminantium lysine decarboxylase by ATP-dependent protease"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 66(6). 1431-143

Yoshihiro Yamaguchi、Yumiko Takatsuka、Yoshiyuki Kamio：“鉴定 ATP 依赖性蛋白酶降解 Selenomonas ruminantium 赖氨酸脱羧酶所需的 22-kDa 蛋白质”生物科学、生物技术和生物化学。