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リボソーム蛋白質が分解制御因子として機能する新規ポリアミン合成制御機構の解明

阐明核糖体蛋白作为降解控制因子的新型多胺合成控制机制

基本信息

批准号：
22780060
负责人：
高塚由美子
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010-04-01 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

反芻動物ルーメン(第一胃)の主要共生細菌で、偏性嫌気性のグラム陰性菌 Selenomonas ruminantiumは、細胞壁に必須構成成分としてポリアミンを共有結合している。本菌のポリアミン生合成に必須なリジン/オルニチン脱炭酸酵素(LDC/ODC)は、「原核生物には存在しない」とされていたアンチザイム様調節因子が関与する厳密な分解制御を受け、その本体としてリボソーム蛋白質L10が作動する。本研究では生物で初めて見出された、リボソーム構成蛋白質が分解促進因子として機能する分解制御機構の全容を、L10およびプロテアーゼの特性と構造、並びに分解複合体における各因子の相互作用と構造変化に焦点を合わせて解明することを目的としており、当該年度において以下の成果を得た。昨年度において、本分解制御機構に関わるATP依存性セリンプロテアーゼの候補遺伝子として、S.ruminantiumの全ゲノム配列を参考に、真核生物 ODC の分解に関わるプロテアソームの原型ともされるClpP型プロテアーゼに着目し、本遺伝子(clpP)をクローニングして大腸菌での大量発現系を構築、さらにClpP組換え蛋白質を精製して精製標品のペプチダーゼ活性を確認した。本年度においては、ClpP型プロテアーゼによる蛋白質分解活性の発現に必要とされるATP結合サブユニット相当遺伝子(clpx)をクローニングし、大腸菌で大量発現させて、約46kDaの組換え蛋白質を得た。精製したS.ruminantiumのClpPおよびClpX存在下におけるL10依存的なLDC/ODC分解活性を、坑LDC/ODC抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定した。その結果、LDC/ODCがATP依存的に分解されること、またL10やClpXの非存在下では分解が起こらないことが明らかとなり、本分解制御機構に関わるプロテアーゼがClpP型プロテアーゼであり、リボソーム蛋白質がアンチザイム様分解促進因子として働くことを強く示唆する結果を in vitro の再構築系で得ることができた。

The main symbiotic bacteria in the first stomach, the paraneoplastic bacteria Selenomonas ruminantium, and the cell wall must be composed of the main symbiotic bacteria. The biosynthesis of this strain must be controlled by the presence of LDC/ODC, prokaryote, tryptophan, tryptophysin, protein L10, and so on. The purpose of this study is to analyze the characteristics of protein decomposition promoting factors, L10, The following achievements will be awarded in the current year. Last year, the decomposing and controlling mechanism was responsible for the detection of ATP-dependent pathogens. The whole cycle of S.ruminantium was equipped with reference, eukaryotes, ODC, CLPP, CPP, CPP, and so on. The ClpP tissue protein was used to confirm the activity of the product. This year, the activity of proteolytic activity of ATP, CLPP, CPP, clpx, CPP, CLPP, CLP, ATP, clpx, CLP, CL In the presence of S.ruminantium, ClpP, ClpX, L10-dependent LDC/ODC decomposition activity, pit LDC/ODC antibody was used to determine the activity of LDC/ODC. The results of the experiment, the decomposition of LDC/ODC ATP-dependent data, the non-existence of L10 ClpX, the decomposition of CPP model, the application of CPP, and the application of CPP. In this paper, the protein was used to analyze the decomposition promoting factor. The results showed that the in vitro system had a significant effect on the decomposition.