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リボソーム蛋白質が分解制御因子として機能する新規ポリアミン合成制御機構の解明

阐明核糖体蛋白作为降解控制因子的新型多胺合成控制机制

基本信息

批准号：
22780060
负责人：
高塚由美子
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010-04-01 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

反芻動物ルーメン(第一胃)の主要共生細菌で、偏性嫌気性のグラム陰性菌 Selenomonas ruminantiumは、細胞壁に必須構成成分としてポリアミンを共有結合している。本菌のポリアミン生合成に必須なリジン/オルニチン脱炭酸酵素(LDC/ODC)は、「原核生物には存在しない」とされていたアンチザイム様調節因子が関与する厳密な分解制御を受け、その本体としてリボソーム蛋白質L10が作動する。本研究では生物で初めて見出された、リボソーム構成蛋白質が分解促進因子として機能する分解制御機構の全容を、L10およびプロテアーゼの特性と構造、並びに分解複合体における各因子の相互作用と構造変化に焦点を合わせて解明することを目的としており、当該年度において以下の成果を得た。昨年度において、本分解制御機構に関わるATP依存性セリンプロテアーゼの候補遺伝子として、S.ruminantiumの全ゲノム配列を参考に、真核生物 ODC の分解に関わるプロテアソームの原型ともされるClpP型プロテアーゼに着目し、本遺伝子(clpP)をクローニングして大腸菌での大量発現系を構築、さらにClpP組換え蛋白質を精製して精製標品のペプチダーゼ活性を確認した。本年度においては、ClpP型プロテアーゼによる蛋白質分解活性の発現に必要とされるATP結合サブユニット相当遺伝子(clpx)をクローニングし、大腸菌で大量発現させて、約46kDaの組換え蛋白質を得た。精製したS.ruminantiumのClpPおよびClpX存在下におけるL10依存的なLDC/ODC分解活性を、坑LDC/ODC抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定した。その結果、LDC/ODCがATP依存的に分解されること、またL10やClpXの非存在下では分解が起こらないことが明らかとなり、本分解制御機構に関わるプロテアーゼがClpP型プロテアーゼであり、リボソーム蛋白質がアンチザイム様分解促進因子として働くことを強く示唆する結果を in vitro の再構築系で得ることができた。

The main symbiotic bacteria of ruminants (the first stomach), the heterotrophic negative bacteria Selenomonas ruminantium, and the cell wall must be composed of components. The alkaline decarboxylase (LDC/ODC), which is essential for the production and synthesis of polysaccharides in this bacterium, is closely controlled by the alkaline cell-like regulatory factors that "exist in prokaryotes" and is involved in the production and synthesis of polysaccharides, and the alkaline cell protein L10 can operate. This study is based on the results of the study of the interaction and structure of the components of the protein decomposition promoter and the function of the decomposition control mechanism, the L10 and the decomposition complex, and the analysis of the protein decomposition promoter and the function. In the past year, this decomposition control mechanism related to ATP dependence of the host cell candidate gene, S. luminantium complete sequence reference, eukaryotic ODC decomposition related to the host cell prototype, ClpP type host cell candidate gene, clpP type host cell candidate gene, Escherichia coli large number of development system construction, Clp group protein purification This year, a large amount of ATP-binding protein (clpx) was found in Escherichia coli, and a protein of about 46kDa was obtained. In the presence of ClpP and ClpX, purified S.ruminantium was used to determine the decomposition activity of LDC/ODC dependent on L10. As a result, LDC/ODC is decomposed into ATP-dependent components in the absence of L10 and ClpX. This decomposition mechanism is related to the decomposition of ClpP-type components.