リボソーム蛋白質が分解制御因子として機能する新規ポリアミン合成制御機構の解明

阐明核糖体蛋白作为降解控制因子的新型多胺合成控制机制

基本信息

批准号：
22780060
负责人：
高塚由美子
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010-04-01 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

反芻動物ルーメン(第一胃)の主要共生細菌で、偏性嫌気性のグラム陰性菌 Selenomonas ruminantiumは、細胞壁に必須構成成分としてポリアミンを共有結合している。本菌のポリアミン生合成に必須なリジン/オルニチン脱炭酸酵素(LDC/ODC)は、「原核生物には存在しない」とされていたアンチザイム様調節因子が関与する厳密な分解制御を受け、その本体としてリボソーム蛋白質L10が作動する。本研究では生物で初めて見出された、リボソーム構成蛋白質が分解促進因子として機能する分解制御機構の全容を、L10およびプロテアーゼの特性と構造、並びに分解複合体における各因子の相互作用と構造変化に焦点を合わせて解明することを目的としており、当該年度において以下の成果を得た。昨年度において、本分解制御機構に関わるATP依存性セリンプロテアーゼの候補遺伝子として、S.ruminantiumの全ゲノム配列を参考に、真核生物 ODC の分解に関わるプロテアソームの原型ともされるClpP型プロテアーゼに着目し、本遺伝子(clpP)をクローニングして大腸菌での大量発現系を構築、さらにClpP組換え蛋白質を精製して精製標品のペプチダーゼ活性を確認した。本年度においては、ClpP型プロテアーゼによる蛋白質分解活性の発現に必要とされるATP結合サブユニット相当遺伝子(clpx)をクローニングし、大腸菌で大量発現させて、約46kDaの組換え蛋白質を得た。精製したS.ruminantiumのClpPおよびClpX存在下におけるL10依存的なLDC/ODC分解活性を、坑LDC/ODC抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定した。その結果、LDC/ODCがATP依存的に分解されること、またL10やClpXの非存在下では分解が起こらないことが明らかとなり、本分解制御機構に関わるプロテアーゼがClpP型プロテアーゼであり、リボソーム蛋白質がアンチザイム様分解促進因子として働くことを強く示唆する結果を in vitro の再構築系で得ることができた。

强大的厌氧革兰氏阴性细菌硒蛋白酶素，这是反刍动物瘤胃中的主要共生细菌（瘤胃），共价将多胺作为基本成分与细胞壁结合。赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶（LDC/ODC）对于这种细菌中多胺的生物合成至关重要，它经受了严格的降解控制，涉及抗精神经会样调节剂，据说“在原始蛋白质中不存在”，而核糖体蛋白质L10则是其主体的作用。这项研究旨在阐明在生物体中最初发现的降解控制机制的全部程度，在这种有机体中，核糖体 - 统计蛋白通过关注L10和蛋白酶的性质和结构以及蛋白酶的性质和结构，以及每个因素的相互作用和结构变化，以及以下降解复合物的相互作用和结构变化，从而可获得了以下结果，并在下面的相互作用和结构变化中可获得以下结果。 Last year, we focused on the ClpP-type protease, which is the proteasome that is involved in the degradation of eukaryotic ODCs, as a candidate gene for the ATP-dependent serine protease involved in the degradation control mechanism, using the whole genome sequence of S.ruminantium, and focused on the ClpP-type protease, which is the prototype of the proteasome involved in the degradation of真核ODC，并在大肠杆菌中构建了一个大规模的表达系统，并进一步纯化了CLPP重组蛋白，以确认纯化制剂的肽酶活性。在今年，将ATP结合亚基当量基因（CLPX）克隆并在大肠杆菌中以大量的大量表达蛋白水解活性所必需，以获得约46 kDa的重组蛋白。在存在CLPP和CLPX的情况下，通过抗LIDC/ODC抗体的蛋白质印迹确定了纯化的反刍动物的LDC/ODC降解活性。 As a result, it was revealed that LDC/ODC is degraded in an ATP-dependent manner, and that degradation does not occur in the absence of L10 or ClpX, and results were obtained in vitro reconstruction systems that strongly suggest that the protease involved in the degradation control mechanism is a ClpP-type protease, and that ribosomal proteins act as antizyme-like degradation promoter.