メダカ可溶性型グアニル酸シクラーゼ遺伝子の転写調節機構及び機能解析

青鳉可溶性鸟苷酸环化酶基因转录调控机制及功能分析

• 批准号: 01J10976
• 负责人: 山本 雄広
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J10976/
• 关键词: NO; cGMP; メダカ; グアニル酸シクラーゼ; cGMP依存性プロテインキナーゼ; 初期発生; マイクロインジェクション; in situ hybridization; 一酸化窒素(NO); 機能阻害; アンチセンスオリゴ; ホールマウントin situハイブリダイゼーション

今年度は、NO/cGMP情報伝達系の初期発生における機能解析を個体レベルで行なうため、アンチセンスオリゴヌクレオチドのメダカ胚への導入による可溶性型グアニル酸シクラーゼ(sGC)および、その主たる下流因子、cGMP依存型プロテインキナーゼ(PKG I)の機能阻害実験を行なった。両者の結果はほぼ同じであり、アンチセンスオリゴ導入胚では後期原腸胚より胚体の左右で死細胞が認められた。また、体節形成の乱れ、中枢神経系、特に眼の形成不全(癒合眼)や耳胞の肥大を引き起こし、本情報伝達系の初期発生における重要性を示した。特に、sGCα_2アンチセンスオリゴ導入胚では尾芽において細胞死が認められた。これは申請者が昨年度明らかにした、初期発生過程におけるnNOS(NO合成酵素)mRNAの発現パターンと一致している。さらに、β_1アンチセンスオリゴ導入胚では著しい発生遅滞が引き起こされる事が明らかになった。このようにβ_1アンチセンスオリゴ導入胚が他の場合に比べ、より重篤な表現型を引き起こすことは、β_1サブユニットがα_1、α_2両サブユニットとダイマーを形成しうるため、α_1/β_1およびα_2/β_1両型の活性型酵素の機能を阻害することによると考えられる。逆に、PKG Iの過剰発現胚では前脳領域が肥大し、小眼となる個体が観察された。この結果は、すでに報告されているcAMP依存型プロテインキナーゼ(PKA)の機能阻害および過剰発現実験とはまったく逆の表現型を示した。また、初期発生におけるPKGの基質候補の一つであった、転写因子Gliがin vivoにおいてもNO/cGMP情報伝達系でリン酸化されることを哺乳類培養細胞を用いた実験で明らかにした。GliはPKAによって活性調節を受けることがすでに報告されており、このような結果はGliを通じたcAMPシグナルとcGMPシグナルのクロストークが初期発生においては重要であることを示唆している(投稿準備中)。さらに、sGCα_2サブユニットの機能解析を行なうにあたり、メダカBACライブラリーよりメダカsGCα_2サブユニット遺伝子を単離(全長約42kbp)し、その遺伝子構造、発現組織、転写開始点等を明らかにした(Zoological Science誌2003年20巻10号1293-1304頁)。また、その転写調節領域の解析も行い、そのプロモーター中にサイレンサー領域を見出し、この領域がsGCα_2サブユニットの転写活性に重要であることを明らかにした(投稿準備中)。

This year, the functional analysis of NO/cGMP information transfer system in the early stage of development, individual transformation, transformation, The result is that the embryo is introduced into the embryo, and the dead cells on the left and right sides of the embryo are recognized. This paper shows the importance of early development of the information system, such as disorder of somite formation, central nervous system, incomplete formation of special eyes (healing eyes), hypertrophy of ear cells, etc. In particular, sGCα_2 is introduced into the embryo, and the tail bud is introduced into the cell. The expression of nNOS(NO synthase)mRNA in the early stages of development was consistent with that in the early stages of development. In addition, the β_1-induced apoptosis was observed in the middle of the cell cycle. The β_1/α_2/α_1/α_2/β_1/α_2/β_1/α_2/β_1/α_2/β_1/αIn contrast, PKG I has developed into a large, small-eyed individual. The results showed that cAMP dependent protein expression (PKA) and protein expression (PKP) were significantly different. PKG matrix candidate in vivo, early development, transcription factor Gli in vivo, NO/cGMP information transfer system, and mammalian culture cells in use. Gli is reported to be involved in the regulation of PKA activity. Results Gli is reported to be involved in the regulation of PKA activity. Gli is reported to be involved in the regulation of cAMP activity. Gli is reported to be involved in the regulation of PKA activity. The functional analysis of GC α_2 and GC α_2 is described in detail below (Zoological Science, 2003, 20:10, pp. 1293-1304). The analysis of the field of writing regulation is in progress, and the field of writing regulation is in progress. The field of writing regulation is in progress. The field of writing regulation is in progress.

项目成果

S.Fujie et al.: "Nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase underlying the modulation of electrical oscillations in a central olfactory organ."Journal of Neurobiology. (印刷中). (2004)

S. Fujie 等人：“一氧化氮合酶和可溶性鸟苷酸环化酶是中枢嗅觉器官电振荡调节的基础。”神经生物学杂志（2004 年出版）。

T.Yamamoto, et al.: "Localization of the Nitric Oxide/cGMP signaling Pathway-Related Genes and Influences of Morpholino Knock-Down of Soluble Guanylyl Cyclase on Medaka Fish Embryogenesis"Zoological Science. (印刷中). (2003)

T. Yamamoto 等人：“一氧化氮/cGMP 信号通路相关基因的定位和可溶性鸟苷酸环化酶的吗啡啉敲低对青鳉鱼胚胎发育的影响”（正在出版）。

Y.Yao et al.: "Genomic structure and expression of soluble guanylyl cyclase α2 subunit gene in the medaka fish Oryzias latipes."Zoological Science. 20巻10号. 1293-1304 (2003)

Y. Yao 等人：“青鳉鱼中可溶性鸟苷酸环化酶 α2 亚基基因的基因组结构和表达。动物学科学”，第 20 卷，第 1293-1304 期。

T.Harumi, et al.: "Expression of Membrane-bound and Soluble Guanylyl Cyclase mRNAs in the Embryonic and Adult Retina of the Medaka Fish Oryzias latipes"Zoological Science. (印刷中). (2003)

T. Harumi 等人：“青鳉鱼胚胎和成体视网膜中膜结合和可溶性鸟苷酸环化酶 mRNA 的表达”动物学科学（2003 年出版）。