Na^+共役型V-ATPaseのイオン輸送分子モーター機構の解析

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Enterococcus hirae Na^+-ATPaseは典型的な液胞型ATPase(V-ATPase)であり、ATP加水分解触媒部位を持つ親水性のV_1部分と、イオン輸送を行う膜内在性のV_0部分から構成される。Na^+結合部位を持つ16kDaのNtpK6量体と共にV_0部分を構成する76kDaのNtpIは、S.cerevisiae V-ATPase及びE.coli F-ATPaseのaサブユニットに相当すると考えられている。前年度に、NtpIサブユニットのArg-573残基がE.hirae V-ATPaseによるNa^+輸送、及び本酵素の示す協同性に必須であることを明らかにしたが、さらにこの必須のArg残基(Arg-573)を含めNtpIのC末端アミノ酸配列がV-ATPase間で高く保存されていることを見出した。本研究ではこれら保存性の高いアミノ酸残基について部位特異的変異導入法により変異体を作製し、NtpIにおいてイオン輸送に関わるアミノ酸残基の同定を試みた。その結果、Arg-573残基に加えて、Y571L, L574R, L577R, E634K変異体ではNa^+-ATPase活性がほとんど観察されず、L577F, H626R, E634Q変異体では活性が著しく低下することを明らかにした。またNtpIのトポロジーについて、SH基反応性試薬を用いたラベル実験からSer-546, Ile-659は細胞外に、Ala-598は細胞質側に面していることが示唆され、必須のアルギニン残基(Arg-573)を含む保存性の高い領域がC末端側2つの膜貫通部位を形成していることが示された。以上の結果から、必須のArg-573残基を含むNtpI C末端領域はV-ATPase間で非常に高く保存されており、V-ATPaseによるイオン輸送において重要な役割を果たしていることを示した。