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植物の細胞分裂の制御機構

植物细胞分裂的控制机制

基本信息

批准号：
13017214
负责人：
関根政実
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13017214/
关键词：
細胞周期タバコ Rb サイクリン E2F 分化ユビキチン分解系

项目摘要

1.タバコサイクリンDの機能解析昆虫細胞発現系により調製したタバコサイクリンD3がCdc2aと複合体を形成し、ヒストンH1とRbタンパク質をin vitroでリン酸化することを見い出した。また、タバコサイクリンDにGFPを融合させて、形質転換BY-2を作出し、細胞内局在性を解析した。野生型は核に局在するが、リン酸化部位変異体(T191A)は主に細胞質に局在することが分かった。T191Aを昆虫細胞発現系により調製したところ、Cdc2aと複合体を形成するがヒストンH1キナーゼ活性が低下し、サイクリンDの191番目のスレオニンが核への局在性とキナーゼ活性に必要であることが示唆された。次に、DNAヒストグラムを解析したところ、野生型の高発現によってG1期の細胞の割合が減少してS期の割合が増加し、タバコサイクリンD3がG1期からS期への移行を促進することが示唆された。また、グルココルチコイド誘導発現系を用いた実験系を確立し、リン酸化部位変異体(S296,300A)は野生型より安定だが、T191Aでは安定性が低いことが分かった。現在、他のタイプのサイクリンD3と供に、タバコRbの推定リン酸化部位を含むペプチドを合成して、各サイクリン/Cdc2a複合体の基質特異性を解析している。2.タバコRbの機能解析タバコRbにある13ケ所の推定リン酸化部位変異体を構築し、誘導発現系を用いて形質転換BY-2を作出した。誘導処理により細胞の成長が抑制されることが明らかになった。また、タバコRb抗体を作製し、Western解析によりBY-2細胞では植え継ぎ後5日目までは蓄積しているが、それ以降の増殖停止期では検出されないことが分かった。mRNAはどの時期でもほぼ同程度蓄積し、阻害剤を用いた解析により、Rbタンパク質が増殖停止期でユビキチン-プロテアソーム系によって分解されることが示唆された。また、[35S]メチオニンの取り込み後Rb抗体による免疫沈降により、増殖停止期でも新規合成は起こっていることが明らかになった。3.タバコE2Fの機能解析イネPCNAプロモーターをレポーターとした一過的な解析系により、タバコE2FがシロイヌナズナDPaと共発現することによって転写活性化が起きることが分かった。この系にタバコRbを発現させると量依存的にE2Fの転写活性化が抑制され、さらにサイクリンD3を発現させることによりRbによる抑制が回復することが示された。また、サイクリンA、BではRbの抑制が回復されないことから、サイクリンD3/Cdc2aによるRbのリン酸化が、RbによるE2Fの転写活性化の抑制からの回復に関与することが示唆された。

1. Functional analysis of insect cell development system: modulation of Cdc2a complex; formation of Cdc2a complex; and characterization of Cdc2a complex in vitro. GFP fusion, morphological transformation BY-2, and intracellular localization wild-type nucleus is located in the middle of the nucleus, and the acid site is different (T191A). The modulation of T191A in insect cell development systems and the formation of the Cdc2a complex result in a decrease in the activity of Sistern H1, which is necessary for the central and central activity of the 191-order Sistern of Serikrin D. In addition, the high occurrence of wild-type DNA fragments, the decrease of G1-phase DNA fragments, the increase of S-phase DNA fragments, and the promotion of D3-G1-S-phase DNA fragments were also observed. In addition, the stability of wild type (S296, 300A) and wild type (T191A) is low. Now, we analyze the matrix specificity of each protein/Cdc2a complex, including the synthesis of protein and the putative acidified sites of protein. 2. The function analysis of Rb is carried out BY constructing and inducing the system of acidification. The induction treatment inhibited the growth of the cells. By Western analysis, Rb antibody was detected in BY-2 cells 5 days after implantation and accumulated in BY-2 cells 5 days after implantation. mRNA accumulation in different stages, inhibition of protein use, analysis of protein expression, protein expression, protein, protein, protein [35S]- 3. The function analysis of E2F is to generate PCNA and DPa. The analysis system of E2F is to generate PCNA and DPa. This is a quantity-dependent activation of E2F in the presence of Rb, which inhibits the presence of Rb in the presence of D3. The inhibition of Rb in A and B is related to the inhibition of Rb in D3/Cdc2a and the inhibition of Rb in E2F.