AMPA型グルタミン酸受容体のエンドサイトーシスの分子機構

AMPA型谷氨酸受体内吞作用的分子机制

基本信息

批准号：
13041045
负责人：
竹居孝二
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.膵島β細胞株MIN6のキャラクタライゼイション膵島β細胞にはAMPA受容体が発現していることが見い出されており、本研究ではAMPA受容体のエンドサイトーシスの機構を解明するためにβ細胞を用いることを提案した。まず特異的抗体を用いたWestern blot法により、MIN6におけるAMPA受容体の発現を明らかにした。次にMIN6におけるエンドサイトーシス機能タンパクの発現を調べた。その結果、クラスリン依存性エンドサイトーシスの機能タンパクであるアンフィファイジン、さらにアンフィファイジンのリン酸化酵素CDK5が高発現することがWestern blot法により見い出された。2.エンドサイトーシスのin vitro再構成系の確立AMPA受容体エンドサイトーシスの分子メカニズム解明のためには、エンドサイトーシスによる取り込み小胞の形成をin vitroで再現する実験系の確立が必要であると考えた。In vitroで人工脂質膜(リポソーム)を膜成分として、ATPおよびGTP存在下に細胞質と反応させることにより、大型(直径>1μm)のリポソームから直径100nm以下の小胞が多数形成される実験系を確立した。さらに、形成された小胞の大きさ、数、相対的質量を動的光拡散測定装置を用いて測定することにより、小胞形成の定量化を可能とした。この実験系はAMPA受容体の選択的取り込みを解析するための実験系として応用されうる。

1。胰岛β细胞系MIN6的表征，已经发现AMPA受体在胰岛β细胞中表达，在这项研究中，我们建议使用β细胞阐明AMPA受体内吞作用机理。首先，使用特定抗体通过蛋白质印迹法揭示了AMPA受体在MIN6中的表达。然后检查了内吞蛋白质蛋白在MIN6中的表达。结果，Western印迹方法发现，两亲蛋白是一种用于网格蛋白依赖性内吞作用的功能蛋白，而磷酸烯酶CDK5（是两亲蛋白）得到了高度表达。 2。建立内吞作用的体外重构体系，以阐明AMPA受体内吞作用的分子机制，人们认为有必要建立一个实验系统，该实验系统通过体外内吞作用来重现摄取囊泡的形成。在体外建立了一个实验系统，其中人造脂质膜（脂质体）在ATP和GTP存在下与细胞质反应，从而形成了大量直径为100 nm的囊泡，其直径为100 nm或更少，从大（>1μm）脂质体形成。此外，通过使用动态光扩散测量装置测量形成的囊泡的大小，数量和相对质量，可以量化囊泡的形成。该实验系统可以用作实验系统，用于分析AMPA受体的选择性摄取。