エンドサイト-シス小胞形成のリアルタイム観察

实时观察内吞顺式囊泡形成

基本信息

批准号：
15657028
负责人：
竹居孝二
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ファゴサイトーシスの分子機構解明のために、セルトリ細胞を用いてファゴサイトーシスのリアルタイム観察を行った。まず、セルトリ細胞株SerW3にフォスファチジルセリン(PS)を認識する受容体(SR-B1)が発現していることをウエスタンブロットにより確認し、細胞膜における局在のパターンを蛍光免疫染色により明らかにした。次に、SerW3細胞によるPS含有大型リポゾーム取込みを経時的、定量的に調べることにより、セルトリ細胞のファゴサイトーシスが、SR-B1を介してPS依存性に起こることを明らかにした。SerW3細胞に、PS含有リポゾームあるいはPSで被覆したスチレンビーズを貪食させ、その様子を超高速共焦点レーザー顕微鏡下でリアルタイム観察したところ、ファゴサイトーシスにおけるpseudo pod形成に先立って糸状突起やラッフルの形成など、F-アクチンの再編成による細胞膜の形態変化が著明に認められた。PS刺激からアクチン重合、ラッフル形成にいたる経路には、フォスファチジルイノシトール3リン酸キナーゼ、Rac、cdc42が関与することが阻害剤を用いた実験により示された。GFP-アンフィファイジン1を発現させたSerW3細胞をライブイメージングにより観察すると、ラッフル形成に伴ってアンフィファイジン1がラッフルに集積する様子が認められた。SerW3細胞のアンフィファイジン1をRNAiによりノックダウンするとラッフル形成が抑制されたことから、アンフィファイジン1がファゴサイトーシス初期におけるアクチンフィラメントの再編成に関与することが示唆された。

为了阐明吞噬作用的分子机制，使用Sertoli细胞对吞噬作用进行了实时观察。首先，通过Western印迹证实，在Serw3中表达了识别磷脂酰丝氨酸（PS）的受体（SR-B1），并且通过荧光免疫染色显示了细胞膜中的定位模式。接下来，通过随时间和定量检查Serw3细胞含有大的含PS的脂质体摄取，我们揭示了Sertoli细胞中的吞噬作用通过SR-B1以PS依赖性方式发生。用含PS的脂质体或PS涂层的苯乙烯珠吞噬SERW3细胞，以及在超高速度共聚焦激光显微镜下实时观察到它们时，由于F-肌动蛋白重新构造而导致的细胞膜形态发生了显着变化，例如，在fi-actin重新构造的情况下，在细丝的形成期间，pe构成了p pic的形成。清楚地观察到吞噬作用。抑制剂实验表明，磷脂酰肌醇3-磷酸激酶，RAC和CDC42参与了从PS刺激到肌动蛋白聚合和荷叶骨形成的途径。当通过实时成像观察到表达GFP-氨基丁物素1的SerW3细胞时，观察到大二肽1在抽奖中积聚以及抽奖的形成。通过RNAi抑制了抽奖的形成在Serw3细胞中击倒AmphiDhidin-1，这表明在早期吞噬作用期间，Amphifidin-1参与肌动蛋白丝重排。