改良型SAGEによる甲状腺濾胞癌特異的遺伝子の大量スクリーニング

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甲状腺濾胞癌、濾胞腺腫の間で発現量に差のある遺伝子をスクリーニングするためHigh-throughput Differential Screening by SAGE (HDSS)を以下の手順でおこなった。1.甲状腺濾胞癌(widely invasive type)濾胞腺腫(normofollicular type)の新鮮凍結標本よtotal RNAを抽出した。2.改良型SAGE法を用いてそれぞれのmRNA由来のtagを各10000個以上解析し、遺伝子発現プロフィールを作製した。3.両者の遺伝子発現プロフィールを比較し、どちらか一方で発現が無い遺伝子配列を、発現量の多い順にリストアップし、それぞれに対応する40個の18merの5'プライマーを作製した。4.real-time quantitative RT-PCRによる2次スクリーニング3'プライマーとしてpolyAアンカープライマーを使用した。ただし、プライマーのデザインは5'-CGCGCGT13VNの12通りとし、Tagが検出された組織(濾胞癌、濾胞腺腫のいずれか)のRNAを用いて5'プライマーとセットでRT-PCRをかけ、最も増幅効率の良かったものをスクリーニング時の3'プライマーとして選択した。選択されたプライマーセットを用い、SYBR Greenの蛍光をモニターすることで濾胞癌、濾胞腺腫各4検体づつの組織からのmRNAを用いてreal-time quantitative RT-PCRを行い、SAGEで検出された発現量の差の再現性を確認した。40個の候補遺伝子のうち1個で明らかな差がみとめられた。この遺伝子は甲状腺濾胞癌の分子的診断のクライテリアとして使用できるものと考えられ、今後さらに解析を進める予定である。