D周期欠損変異型リコンビナントコラーゲンの人工臓器材料への基礎的研究

D期缺陷突变重组胶原人工器官材料的基础研究

• 批准号: 13771213
• 负责人: 服部 宇
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771213/
• 关键词: プロコラーゲン; cDNAカセット; リコンビナント蛋白; コラーゲン; 担体; 温度安定性; cDNA カセット; リコンビナント

本年度は,昨年度に作製された遺伝子cDNAカセット、1.N-protelo-D1-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(Full length type I procollagen 以下 Full lengthと略す)、2.N-protelo-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(以下-D1)、3.N-protelo-n1-D3-D4-D0.4-C-protelo(以下-D2)、4.N-protelo-D1-D2-D4-D0.4-C-protelo(以下-D3)、5.N-protelo-D1-D2-D3-D0.4-C-protelo(以下-D4)、6.N-protelo-D1-D2-D3-P4-C-protelo(以下-D0.4)(protelo : propeptidetelopeptide)をtransfection vector(pcDNA3.1(+))に挿入し、リン酸カルシウム法にて哺乳動物細胞(HT-1080)に遺伝子導入,リコンビナント蛋白の抽出,精製を行った。リコンビナント蛋白はそれぞれT175cm^220個にて大量培養を行い、Western Blotting、Northern Blottingにてそれぞれの蛋白を確認した。Full length、-D1以外は蛋白の安定性、温度安定性が得られず、人工臓器材料としての安定性、利用性は認められなかった。安定な蛋白として得られたFull length、-D1については35℃から42℃の温度安定性では問題なく、生体内での蛋白としての安定性に問題のないことが示唆された。また、ATP incubationを行い、SLSを作製し、遣伝子配列、欠損の状態に対応したアミノ酸配列、三重らせん形成を視認することが可能となり、他の蛋白への応用への道を開いた。Full length、-D1の蛋白を培養フラスコにコーティングし、線維芽細胞、軟骨細胞を培養した。コントロールとして牛由来type Icollagen coatingフラスコを用いた。コントロールと比較し、Full lengthと-D1では細胞の増殖、形態に遜色は認められなかった。また、リコンビナントヒトBMPをFull lengthと-D1蛋自を担体として、マウス大腿筋膜下へ移植した。担体のコントロールとして牛由来アテロコラーゲンを用いた。コントロール、両者ともに骨形成が確認され、骨形成量に差は認められなかったが、組織学的検討により、炎症反応は-D1蛋白を担体として用いたものが一番少なかった。これは担体としての吸収、Drug deliveryシステムとしての有用性が示唆された。以上より、D周期欠損変異型リコンビナントコラーゲンの中で-D1蛋白は人工臓器材料としての温度安定性、生化学的安定性に問題なく、また易吸収性、炎症反応の少ない担体としての有用性が示唆された。

This year, compared with last year, the production of cDNA fragments was carried out by 1.N-protelo-D1-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo (Full length type I procollagen below Full length), 2.N-protelo-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(below-D1), 3.N-protelo-n1-D3-D4-D0.4-C-protelo(below-D2), 4.N-protelo-D1-D2-D4-D0.4-C-protelo(below-D3), 5.N-protelo-D1-D2-D3-D0.4-C-protelo(hereinafter-D4), 6.N-protelo-D1-D2-D3-P4-C-protelo(hereinafter-D0.4)(protelo : proptidetection peptide), transfection vector(pcDNA3.1(+)), gene transfer into mammalian cells (HT-1080), gene extraction and purification. T175cm^220 cells were identified by Western Blotting and Northern Blotting. Full length, -D1 protein stability, temperature stability, artificial equipment material stability, utilization, etc. The stability of protein is Full length, -D1, 35℃, 42℃, and in vivo. ATP incubation, SLS control, protein alignment, deficient state, acid alignment, triple formation, recognition, and other protein utilization pathways are open. Full length, -D1 protein culture, cell culture, cell culture The type of collagen coating is used to coat the skin. Full length-D1-cell growth, morphology, and cell differentiation The Full length of the BMP is 1 mm and the lower thigh fascia is 2 mm long. The reason for this is that the number of people in the country is increasing. Bone formation has been confirmed in Kontaro, Shizoku, and Mochi, and the difference in the amount of bone formation has been confirmed. Histological analysis has revealed that the inflammatory response is mediated by the D1 protein. The Drug delivery system is useful for drug absorption and drug delivery. The above-mentioned problems of temperature stability and biochemical stability of artificial device materials, easy absorption, and less support for inflammatory reactions are demonstrated.