生分解性を有する水溶性ポリマーの構造と酵素分解性の解明

具有生物降解性的水溶性聚合物的结构和酶降解性的阐明

• 批准号: 13780461
• 负责人: 平石 知裕
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780461/
• 关键词: ポリアスパラギン酸; ポリアスパラギン酸分解酵素; ポリ(3-ヒドロキシブタン酸)分解酵素; オリゴアスパラギン酸分解酵素; β-アスパラギン酸

平成14年度の研究成果1.ポリアスパラギン酸分解酵素遺伝子のクローニングとキャラクタリゼーションポリアスパラギン酸分解酵素のクローニングをLA PCR in vitro cloningにより行った。その結果、本分解酵素遺伝子のクローニングに世界で初めて成功した。遺伝子解析の結果、本酵素遺伝子は942bpから構成されていた。さらにコードされるポリペプチドは314アミノ酸残基からなり、N末端の35アミノ酸残基がシグナルペプチドであることが分かった。また、本酵素では、176位のセリン残基が活性中心であるリパーゼボックスを構成していることが明らかとなった。また、FASTAを用いた相同性検索の結果、本酵素はAlcaligenes faecalis AE122およびPseudomonas lemoignei由来のポリ(3-ヒドロキシブタン酸)分解酵素と類似していることが分かった。2.オリゴアスパラギン酸分解酵素の精製とキャラクタリゼーション(1)オリゴアスパラギン酸分解酵素の精製Sphingomonas sp.KT-1株の細胞破砕液から、陽イオン交換カラムおよびヒドロキシアパタイトカラムを用いることによりオリゴアスパラギン酸分解酵素の精製に成功した。(2)オリゴアスパラギン酸分解酵素のキャラクタリゼーション本分解酵素は、分子量が約42000のタンパク質であった。BLASTを用いた相同性検索の結果、本酵素のN末端アミノ酸配列はCaulobacter crescentus CB15由来のM20/M25/M40ファミリーに属する金属ペプチダーゼと高い相同性を有していることが分かった。また、本酵素の種々の性質を調べたところ、等電点plは9.6、至適pHは7.0であり、至適温度は55℃であることが分かった。さらに、本酵素は金属ペプチダーゼ阻害剤であるEDTAにより著しく阻害されることが分かった。

Pp.47-53 14 year の research 1. ポ リ ア ス パ ラ ギ ン traces of acid protease 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ と キ ャ ラ ク タ リ ゼ ー シ ョ ン ポ リ ア ス パ ラ ギ ン acid decomposition enzyme の ク ロ ー ニ ン グ を LA PCR in vitro cloning に よ り line っ た. The そ そ result: the 伝 subzyme of this enzyme is 伝 ロ ロ ニ <e:1> グに グに. The world で initial めて success is た. The result of the analysis of the 伝 subsubtor and the 伝 subsubsubtor of this enzyme, <s:1> 942bp ら ら, constitute されて た た. さ ら に コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プ チ ド は 314 ア ミ ノ acid residues か ら な り, N terminal の 35 ア ミ ノ acid residues が シ グ ナ ル ペ プ チ ド で あ る こ と が points か っ た. ま た, this enzyme で は, 176 の セ リ ン residues が active center で あ る リ パ ー ゼ ボ ッ ク ス を constitute し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. ま た, FASTA を with い た identity 検 cable の results, this enzyme is は Alcaligenes faecalis AE122 お よ び Pseudomonas lemoignei origin の ポ リ (3 - ヒ ド ロ キ シ ブ タ ン acid) decomposition enzyme と similar し て い る こ と が points か っ た. 2. オ リ ゴ ア ス パ ラ ギ ン acid decomposition enzyme の refined と キ ャ ラ ク タ リ ゼ ー シ ョ ン (1) オ リ ゴ ア ス パ ラ ギ ン の refined Sphingomonas acid decomposition enzymes Sp. KT - 1 strain の cells 砕 breaking liquid か ら, Yang イ オ ン exchange カ ラ ム お よ び ヒ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト カ ラ ム を with い る こ と に よ り オ リ ゴ ア ス パ ラ ギ ン acid decomposition enzyme の refined に successful し た. (2) オ リ ゴ ア ス パ ラ ギ ン acid decomposition enzyme の キ ャ ラ ク タ リ ゼ ー シ ョ ン は this decomposition enzyme, molecular weight about 42000 の が タ ン パ ク qualitative で あ っ た. BLAST を with い た identity 検 cable の results, this enzyme is の N terminal ア ミ ノ acid with column は Caulobacter crescentus CB15 origin の M20 M25 / M40 フ ァ ミ リ ー に genus す る metal ペ プ チ ダ ー ゼ と high い phase gay を し て い る こ と が points か っ た. ま た, this enzyme の 々 の nature を adjustable べ た と こ ろ, isoelectric point pl は 9.6, to optimum pH 7.0 で は あ り 55 ℃, to optimum temperature は で あ る こ と が points か っ た. さ ら に, this enzyme は metal ペ プ チ ダ ー ゼ resistance against tonic で あ る EDTA に よ り the し く resistance against さ れ る こ と が points か っ た.

项目成果

Tomohiro Hiraishi: "Genetic Analysis and Characterization of Poly (aspartic acid) Hydrolase-1 from Sphingomonas sp.KT-1"Biomacromolecules. 3月号(in press). (2003)

Tomohiro Hiraishi：“来自鞘氨醇单胞菌 KT-1 的聚（天冬氨酸）水解酶 - 1 的遗传分析和表征”生物大分子三月号（2003 年）。

平石知裕: "Microbial and enzymatic hydrolysis of poly(aspartic acid)"RIKEN Review. 42. 81-84 (2001)

Tomohiro Hiraishi：“聚天冬氨酸的微生物和酶水解”RIKEN Review。 42. 81-84 (2001)

田畠健治: "Purification and characterization of poly(aspartic acid) hydrolase from Sphingomonas sp. KT-1"Biomacromolecules. 2. 1155-1160 (2001)

Kenji Tabata：“来自鞘氨醇单胞菌 KT-1 的聚天冬氨酸水解酶的纯化和表征”生物大分子。 2. 1155-1160 (2001)