培養胎仔鼻板のGnRHニューロンを用いてGnRHサージ発生器を作成する試み

尝试使用培养的胎儿鼻板 GnRH 神经元创建 GnRH 浪涌发生器

• 批准号: 13877011
• 负责人: 田中 冨久子
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13877011/
• 关键词: エストロジェン; 培養; 鼻板; GnRHサージ; GABA; bicuculline; GT1-7; serum shock

我々が既に確立した方法により、13.5日齢の胎仔鼻板を25%血清含有培養液で回転培養し、2-5週間後に実験に用いた。実験前日に10%血清含有培養液に交換した。サンプリングは、10分間隔で5時間にわたり909μlの全培養液を回収し、新しいものと交換することにより行った。サンプリング前日もしくは72時間前より1-100nMエストロジェンを培養液中に投与した。100μMのGABA_A受容体アンタゴニスト、ビククリンをサンプリング開始2時間後より2時間にわたり培養液中に投与した。回収した培養液中のGnRH濃度を、高感度EIAにより測定した。その結果、培養2週間目の実験では、エストロジェンの有無、投与期間にかかわらず、ビククリン投与によりGnRH分泌が増加した。しかし、この分泌増加は、1)エストロジェン依存性ではないこと、2)増加量はそれほど多くないこと、から、サージ状GnRH分泌とは認められないと考えられた。この原因の一つとして培養期間が短くGnRHニューロンがサージ発生器に分化出来なかった可能性を考え、培養期間を延長し、同様の実験を行った。その結果、培養5週間目の実験では、ビククリンによりGnRH分泌は増加したものの、培養2週間目と比較して、大きな違いは認められなかった。現在、さらに培養期間を8週間にして検討を行っている。一方、視床下部GnRHニューロン由来の細胞株で、パルス状にGnRHを分泌することが知られているGT1-7細胞を用いて、サージ状のGnRH分泌が惹起できるか否かも検討した。定型的に5%CO2存在下で5%牛胎仔血清添加D-MEM/F12にて培養し、ある種の細胞株にサーカディアンリズムを惹起することが知られている50%血清刺激を4時間行った。4時間間隔で培養液を回収し、GnRH濃度を測定した。その結果、血清刺激8-12時間後に、前値と比較して約5倍のGnRH分泌の増加が認められた。今後エストロジェン刺激によっても同様のことが起こるのか検討する予定である。

I 々 が に already established し た method に よ り, 13.5 days 齢 の tire tsai nose を で planning training し, 25% serum contains the culture between 2-5 weeks after に be 験 に with い た. The day before the experiment, に10% serum containing culture medium に was exchanged for <s:1> た. サ ン プ リ ン グ は, 10 points 5 time interval で に わ た り を back 909 mu l の whole broth 収 し, new し い も の と exchange す る こ と に よ り line っ た. サ ン プ リ ン グ yesterday も し く は before 72 time よ り 1-100 - nm エ ス ト ロ ジ ェ ン を medium, に cast with し た. 100 mu M の GABA_A by let body ア ン タ ゴ ニ ス ト, ビ ク ク リ ン を サ ン プ リ ン グ began after 2 time よ り 2 time に わ た り medium, に cast with し た. Determination of <s:1> GnRH concentration を and high-sensitivity EIAによ in the reproducing た culture medium た た. そ の results, training 2 weeks の be 験 で は, エ ス ト ロ ジ ェ ン の, cast and during に か か わ ら ず, ビ ク ク リ ン cast with に よ り GnRH secretion が raised plus し た. し か し, こ の secretion raised は, 1) エ ス ト ロ ジ ェ ン dependency で は な い こ と amount, 2) raised は そ れ ほ ど more く な い こ と, か ら, サ ー ジ shape GnRH secretion と は recognize め ら れ な い と exam え ら れ た. こ の reason の つ と し て training during short が く GnRH ニ ュ ー ロ ン が サ ー ジ 発 raw device is separated に な か っ た possibility を え test, training period extended を し, with others in の be 験 を line っ た. そ の results and cultivate 5 weeks orders の be 験 で は, ビ ク ク リ ン に よ り GnRH secretion は raised plus し た も の の, comparison between 2 weeks training item と し て, big き な violations い は recognize め ら れ な か っ た. Now, during the さらに culture period of を8 weeks, に て検 て検 discuss を and って る る. Side, depending on the bed bottom GnRH ニ ュ ー ロ ン origin の cell lines で, パ ル ス shape に GnRH secretion を す る こ と が know ら れ て い る GT1-7 cells を using い て, サ ー ジ shape の GnRH secretion が provoked で き る か no か も beg し 検 た. Styling に 5% CO2 in the presence of で added 5% bovine fetal seed serum D - MEM/F12 に て し, あ る kind の cell lines に サ ー カ デ ィ ア ン リ ズ ム を provoked す る こ と が know ら れ て い る 50% serum stimulus を 4 time line っ た. 4. Time interval で culture medium を refluxing を, determination of GnRH concentration を た. Youdaoplaceholder0 そ results: After 8-12 hours of serum stimulation, に compared with the previous value と, the <s:1> GnRH secretion <e:1> increased by approximately 5 times て, and が recognized められた. In the future, the エストロジェ によって stimulation によって エストロジェ will be the same as the <s:1> とが starting from the <s:1> る and the 検 検 検 検 will be discussed and the する will be determined by である.