mNkd遺伝子のマウス個体における胚発生や腫瘍形成への役割の解析

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Wnt-β-catenin-TCF (Wnt)経路は様々な生物の発生や腫瘍形成にとって極めて重要である。マウスNaked Cuticle (mNkd)遺伝子はWntシグナルに誘導され、またantagonistをコードしてWnt経路に拮抗的に作用する。mNkd蛋白はEF-hand (calcium-binding motif)を介してDishevelled (Dvl)に結合する。しかしmNkdの生体内での役割及びその機構についてはまったく明らかにされていない。そこでmNkd遺伝子のマウス個体における発生や癌発生への役割を調べるため、ジーンターゲティング法を用いてmNkd EF-hand欠損マウスの作製を試っている。前回の実績報告書では、ターゲティングベクターを作製し、相同組み換え体をPCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法にて選択し相同組み換え体を得られた。この相同組み換え体ES細胞を初期胚にマイクロインジェクション法により導入し、発生させ、キメラマウスを作製した。そしてキメリズムがほぼ100%のキメラマウスを用いて交配によりmNkd heterozygous (Nkd+/-)マウスを得た段階まで歩んだ。その後、Nkd+/-マウス同士の交配を行って、homozygous (Nkd-/-)マウスを獲得した。Nkd+/-マウス及びNkd-/-マウス全てはPCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法にてgenotypeを確認した。またNorthern Blot、R-PCR及びsequencing法にてNkd-/-マウスの肺や精巣などからEF-handを飛ばした転写産物が認められ、この欠損領域にはmNkdがWnt経路への拮抗作用に重要な残基が含まれる。さらに蛋白質産物を確認するため、mNkdに対する特異的な抗体を作成した。この抗体を用いてNkd-/-マウスにおいてはWestern Blot法でも正常なmNkd蛋白質産物が消失し、その代りEF-hand欠損されたmNkd蛋白質産物の出現を確認できた。ここまではmNkd EF-hand欠損マウスの作製に成功した。Nkd-/-マウスは正常に発生し、現在20週齢になった。この結果からmNkdが胚発生に必須ではないことがわかった。また解剖学の解析を行ったところ、wild typeやNkd+/-マウスに比べ、Nkd-/-マウスにおいては特に大きな異常は見出されないが、精巣の重量やlitter sizeが減少したことを見出した。その機構を探るため、精巣上体から精子を取り出し、精子の数、運動能力、さらに精巣切方にて染色法で精子形成異常の有無を調べている。またmNkd発現している臓器を知るため、脳、肺、精巣を含め12種の臓器のmRNAに対してNorthern Blotを行った結果、肺では非常に高い発現、脳、皮膚、胃、腎臓、及び精巣にも高い発現、小腸や心臓に弱い発現していることがわかった。これらのmNkd発現している臓器に着目し、マウスの成長に伴って生化学的、組織学的、病理学的各解析を行い、特に腫瘍形成の有無の調査を展開して行く。