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mNkd遺伝子のマウス個体における胚発生や腫瘍形成への役割の解析

mNkd基因在小鼠胚胎发育和肿瘤发生中的作用分析

基本信息

批准号：
02F00528
负责人：
武藤誠
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00528/
关键词：
Wnt経路 mNkd ノックアウトマウス胚発生癌発生 litter size 精巣精子

项目摘要

Wnt-β-catenin-TCF (Wnt)経路は様々な生物の発生や腫瘍形成にとって極めて重要である。マウスNaked Cuticle (mNkd)遺伝子はWntシグナルに誘導され、またantagonistをコードしてWnt経路に拮抗的に作用する。mNkd蛋白はEF-hand (calcium-binding motif)を介してDishevelled (Dvl)に結合する。しかしmNkdの生体内での役割及びその機構についてはまったく明らかにされていない。そこでmNkd遺伝子のマウス個体における発生や癌発生への役割を調べるため、ジーンターゲティング法を用いてmNkd EF-hand欠損マウスの作製を試っている。前回の実績報告書では、ターゲティングベクターを作製し、相同組み換え体をPCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法にて選択し相同組み換え体を得られた。この相同組み換え体ES細胞を初期胚にマイクロインジェクション法により導入し、発生させ、キメラマウスを作製した。そしてキメリズムがほぼ100%のキメラマウスを用いて交配によりmNkd heterozygous (Nkd+/-)マウスを得た段階まで歩んだ。その後、Nkd+/-マウス同士の交配を行って、homozygous (Nkd-/-)マウスを獲得した。Nkd+/-マウス及びNkd-/-マウス全てはPCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法にてgenotypeを確認した。またNorthern Blot、R-PCR及びsequencing法にてNkd-/-マウスの肺や精巣などからEF-handを飛ばした転写産物が認められ、この欠損領域にはmNkdがWnt経路への拮抗作用に重要な残基が含まれる。さらに蛋白質産物を確認するため、mNkdに対する特異的な抗体を作成した。この抗体を用いてNkd-/-マウスにおいてはWestern Blot法でも正常なmNkd蛋白質産物が消失し、その代りEF-hand欠損されたmNkd蛋白質産物の出現を確認できた。ここまではmNkd EF-hand欠損マウスの作製に成功した。Nkd-/-マウスは正常に発生し、現在20週齢になった。この結果からmNkdが胚発生に必須ではないことがわかった。また解剖学の解析を行ったところ、wild typeやNkd+/-マウスに比べ、Nkd-/-マウスにおいては特に大きな異常は見出されないが、精巣の重量やlitter sizeが減少したことを見出した。その機構を探るため、精巣上体から精子を取り出し、精子の数、運動能力、さらに精巣切方にて染色法で精子形成異常の有無を調べている。またmNkd発現している臓器を知るため、脳、肺、精巣を含め12種の臓器のmRNAに対してNorthern Blotを行った結果、肺では非常に高い発現、脳、皮膚、胃、腎臓、及び精巣にも高い発現、小腸や心臓に弱い発現していることがわかった。これらのmNkd発現している臓器に着目し、マウスの成長に伴って生化学的、組織学的、病理学的各解析を行い、特に腫瘍形成の有無の調査を展開して行く。

Wnt-β-catenin-TCF (Wnt) 経路は様々な生の発生やTumor formation is very important and important.マウスNaked Cuticle (mNkd) 缝子はWntシグナルにinducing され, またantagonistをコードしてWnt経路にantagonistic にeffectする. The mNkd protein has a EF-hand (calcium-binding motif) and a Dishevelled (Dvl) binding.しかしmNkdの生内での杀和びその体についてはまったく明らかにされていない.そこでmNkd伝子のマウス Individual における発生や Cancer発生へのYakuza べるため、ジーンターゲティング法を用いてmNkd EF-hand owed damage to the production of マウスのをtrial っている. The performance report of the previous chapter was produced, and the same group was replaced by PCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法にて Select the same group み Change the body をGet られた. The same group of somatic ES cells were exchanged for the initial embryonic embryo.ション法により Importedし,発生させ,キメラマウスをproducedした. Nkd heterozygous (Nkd+/-)マウスを得たdanstepまで歩んだ. After その, Nkd+/-マウス同士のMATINGを行って, homozygous (Nkd-/-)マウスをgets した. Nkd+/-マウス andびNkd-/-マウス全てはPCR methodやサザンブロットハイブリダイゼーション法にてgenotypeをconfirmationした.またNorthern Blot, R-PCR and びsequencing methodにてNkd-/-マウスのlungや精巣などからEF-handを飞ばした転WRits the product がcognize められ, このloss field にはmNkd がWnt経路へのantagonism にimportant な residue がcontains まれる. The protein product of さらに is confirmed and the antibody specific for mNkdに対する is created.このantibodyを用いてNkd-/-マウスにおいてはWestern The Blot method is used to confirm the disappearance of the normal mNkd protein product and the appearance of the EF-hand defective mNkd protein product.ここまではmNkd EF-hand owed damage to the production of にした. Nkd-/-マウスはNormal pregnancy, now 20 weeks old.このRESULTSからmNkdが発生に必ではないことがわかった.またanatomy analysisを行ったところ、wild typeやNkd+/-マウスに比べ、Nkd-/-マウスにおいては特に大きなAbnormalは见出されないが、精巣のweightやlitter The size is reduced and the size is reduced.そのMechanism をExploration るため、Sperm upper body からSperm をOut りし、Sperm count、motility、Sperm cut square にて staining method でSperm formation abnormality をAdjustment べている.またmNkd発appearsしている蓓器を知るため、脳、lung、精巣をcontains 12 kinds of の蓓器のmRNAに対してNorthern Blot results, lungs are very high, skin, skin, stomach, kidneys, And the sperm is high and the small intestine is weak, and the small intestine is weak and the heart is weak.これらのmNkd発appearsしている臓器に目し、マウスのgrowthに companionってbiochemistry、 The analysis of histology and pathology can be carried out, and the investigation of the presence or absence of special tumor formation can be carried out.