スサビノリのESTを利用した生殖細胞分化に関わる遺伝子の探索と発現解析

使用 Susabinori EST 搜索与生殖细胞分化相关的基因并进行表达分析

• 批准号: 02J00053
• 负责人: 北出 幸広
• 金额: $ 2.43万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J00053/
• 关键词: スサビノリ; EST; 単胞子形成; 国際研究者交流; フランス

今年度の研究実施計画は、前年度マクロアレイ法によって絞り込まれ、cDNA全長配列を取得した8種の候補遺伝子の配偶体における発現部位をwhole-mount in situハイブリダイゼーション(以下WISH)法により調べることであった。しかし、WISH法をスサビノリへ適用した報告例が過去になかったことからまずこの実験系のポジティブコントロール(以下ポジコン)を作る必要が生じた。そこで、今年度はスサビノリで構成的に発現することが知られているEF-1α遺伝子を用いて実験系の開発を試みた。また、候補遺伝子の機能解析を想定して、6ヵ月間フランスで海藻のゲノム研究を推進しているラボと形質転換技術の開発に関する共同研究を行った。【方法】WISH法の開発では、スサビノリTU-1株の配偶体に対して市販の細胞壁分解酵素(MAX酵素)による前処理を行い、プロトプラストと細胞壁を部分分解した若い発芽体を用いた。プローブはEF-1α遺伝子のNon-RI標識したセンスとアンチセンスのリボプローブを用いた。フランスでは主にシオミドロとタマネギを宿主、いくつかのウイルスのプロモーター(EsvやCaMv35Sなど)とレポーター遺伝子(GUSplusやoxoなど)のセットを発現ベクターとして用いてパーティクルガン法による形質転換を試みた。【結果】スサビノリ配偶体を用いたWISH法の適用には、細胞壁の部分分解が必須であることが明らかになった。また、スサビノリの細胞壁はプローブと抗体の両方を細胞内へ通過させないため、ハイブリダイゼーションの前の段階でそれを行うべきであることもわかった。本実験により、アンチセンスプローブのみで陽性シグナルが検出される条件を設定することができた。フランスでの成果として、スサビノリとシオミドロ共通にポジコンとして使えるタマネギを用いた実験系の立ち上げに成功した。

Be our の research project は, before the annual マ ク ロ ア レ イ method に よ っ て ground り 込 ま れ and length cDNA match column を し た eight の alternate heritage 伝 son の gametophyte に お け る を 発 now parts whole - mount in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン method (WISH) に よ り adjustable べ る こ と で あ っ た. し か し, WISH を ス サ ビ ノ リ へ applicable し た report cases が past に な か っ た こ と か ら ま ず こ の be 験 is の ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル (hereinafter ポ ジ コ ン) を る necessary が raw じ た. そ こ で, our は ス サ ビ ノ リ で consisting of に 発 now す る こ と が know ら れ て い る EF - 1 alpha heritage 伝 son を with い て be 験 started の 発 を try み た. ま た, alternate but 伝 の function analytical を scenarios し て, 6 ヵ フ ラ ン ス で algae の ゲ ノ を ム research advance し て い る ラ ボ と form quality planning switch technology の 発 に masato す る joint research line を っ た. 【 method 】 WISH method の open 発 で は, ス サ ビ ノ リ TU - 1 strain の gametophyte に し seaborne て in vendor の cell-wall degradation enzyme (MAX) enzymes に よ る 処 before line を い, プ ロ ト プ ラ ス ト と し wall を part if た い 発 buds を with い た. プ ロ ー ブ は EF - 1 alpha heritage 伝 son の Non - RI logo し た セ ン ス と ア ン チ セ ン ス の リ ボ プ ロ ー ブ を with い た. フ ラ ン ス で は main に シ オ ミ ド ロ と タ マ ネ ギ を host, い く つ か の ウ イ ル ス の プ ロ モ ー タ ー (Esv や CaMv35S な ど) と レ ポ ー タ ー heritage 伝 child (GUSplus や oxo な ど) の セ ッ ト を 発 now ベ ク タ ー と し て in い て パ ー テ ィ ク ル ガ ン method に よ る form quality planning in を try み た. 【 results 】 ス サ ビ ノ リ gametophyte を with い た WISH の applicable に は, cell wall の part decomposition が must で あ る こ と が Ming ら か に な っ た. The cell walls of ま た, ス サ ビ ノ リ の は プ ロ ー ブ と antibody の struck through へ を cell さ せ な い た め, ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の before の Duan Jie で そ れ を line う べ き で あ る こ と も わ か っ た. This be 験 に よ り, ア ン チ セ ン ス プ ロ ー ブ の み で positive シ グ ナ ル が 検 out さ れ を る conditions set す る こ と が で き た. フ ラ ン ス で の results と し て, ス サ ビ ノ リ と シ オ ミ ド ロ common に ポ ジ コ ン と し て make え る タ マ ネ ギ を with い た be fasten 験 の stand on ち げ に successful し た.

项目成果

Kitade Y., Ootsuka S., Iitsuka O., Saga N.: "Effect of DMSO on PCR of Porphyra yezoensis (Rhodophyta) gene."Journal of Applied Phycology. 15. 555-557 (2003)

Kitade Y.、Ootsuka S.、Iitsuka O.、Saga N.：“DMSO 对条斑紫菜（红藻）基因 PCR 的影响。”应用藻类学杂志。

Phenotypic and genetic characterization of the three strains of a marine red alga Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta).

海洋红藻条斑紫菜（Bangiales，红藻门）三种菌株的表型和遗传特征。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Suisanzoshoku (in press)
• 作者: Park E.-J.;Takahashi M.;Kitade Y.;Yasui H.;Saga N.
• 通讯作者: Saga N.

北出幸広: "海藻の分子遺伝学的研究の現状と展望"水産育種. 33. 1-6 (2003)

北出幸弘：“海藻分子遗传学研究现状与展望”，渔业育种，33. 1-6 (2003)。

Tracing of systematic characters of Bangiales(Rhodophyta) based on molecular phylogeny inferred from sequences of nuclear small subunit rRNA genes.

基于核小亚基 rRNA 基因序列推断的分子系统发育追踪红藻门 (Bangiales) 的系统性状。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Suisanzoshoku 52
• 作者: Matsuyama-Serisawa K.;Yamazaki S.;Kitade Y.;Serisawa Y.et al.
• 通讯作者: Serisawa Y.et al.

Yamazaki S., Iitsuka O., Kitade_Y., Shin J.-A., Saga N.: "Molecular phylogenetic study of Porphyra tenera and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta) using SSU rDNA."Fish.Gene.Breed.Sci.. 33. 25-34 (2003)

Yamazaki S.、Iitsuka O.、Kitade_Y.、Shin J.-A.、Saga N.：“使用 SSU rDNA 对淡紫菜和条斑紫菜（Bangiales、Rhodophyta）进行分子系统发育研究。”Fish.Gene.Breed.Sci。