スサビノリのESTを利用した生殖細胞分化に関わる遺伝子の探索と発現解析

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今年度の研究実施計画は、前年度マクロアレイ法によって絞り込まれ、cDNA全長配列を取得した8種の候補遺伝子の配偶体における発現部位をwhole-mount in situハイブリダイゼーション(以下WISH)法により調べることであった。しかし、WISH法をスサビノリへ適用した報告例が過去になかったことからまずこの実験系のポジティブコントロール(以下ポジコン)を作る必要が生じた。そこで、今年度はスサビノリで構成的に発現することが知られているEF-1α遺伝子を用いて実験系の開発を試みた。また、候補遺伝子の機能解析を想定して、6ヵ月間フランスで海藻のゲノム研究を推進しているラボと形質転換技術の開発に関する共同研究を行った。【方法】WISH法の開発では、スサビノリTU-1株の配偶体に対して市販の細胞壁分解酵素(MAX酵素)による前処理を行い、プロトプラストと細胞壁を部分分解した若い発芽体を用いた。プローブはEF-1α遺伝子のNon-RI標識したセンスとアンチセンスのリボプローブを用いた。フランスでは主にシオミドロとタマネギを宿主、いくつかのウイルスのプロモーター(EsvやCaMv35Sなど)とレポーター遺伝子(GUSplusやoxoなど)のセットを発現ベクターとして用いてパーティクルガン法による形質転換を試みた。【結果】スサビノリ配偶体を用いたWISH法の適用には、細胞壁の部分分解が必須であることが明らかになった。また、スサビノリの細胞壁はプローブと抗体の両方を細胞内へ通過させないため、ハイブリダイゼーションの前の段階でそれを行うべきであることもわかった。本実験により、アンチセンスプローブのみで陽性シグナルが検出される条件を設定することができた。フランスでの成果として、スサビノリとシオミドロ共通にポジコンとして使えるタマネギを用いた実験系の立ち上げに成功した。