分子進化機構と立体構造に基づくダイズタンパク質の高機能化設計基盤の確立と応用

基于分子进化机制和3D结构的大豆蛋白高功能化设计平台的建立及应用

• 批准号: 02J01728
• 负责人: 丸山 如江
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J01728/
• 关键词: ダイズ; タンパク質工学; 立体構造

昨年度はダイズタンパク質(コングリシニンα'サブユニット;以下α')の分子内部に血圧降下ペプチド(RPLKPW)配列を導入する設計をし、変異α'の大腸菌発現系の構築を行った。今年度は、引き続き昨年度作成した変異α'の構造形成能の評価を行うと共に、分子表面に血圧降下ペプチドを導入した変異α'を作成し、構造形成能とペプチド派生功率の評価を行った。主な結果は以下のとおりである。(1)分子内部に血圧降下ペプチドを導入した変異体の作成と評価βバレル上に位置し、RPLKPWと比較的類似した配列を持つ部位に、立体構造を考慮してRPLKPW配列を置換導入した。N側ドメインのストランドAに変異を導入したα'(ap169)とC側ドメインのストランドDに変異を導入したα'(ap412)は、いずれも大腸菌発現系において可溶性で発現した。しかし、ゲル濾過カラムに供したところ、会合体を形成していることが明らかになった。野生型とは異なる性質を示したことから、分子内部のバレル領域はRPLKPW配列の導入部位として適当ではない可能性が示唆された。(2)分子表面に血圧降下ペプチドを導入した変異体の作成と評価以前に明らかにしたα'の結晶構造中に、座標を決定できない構造可変領域が、N末端部以外に三箇所存在していた。このような領域は、アミノ酸置換や挿入といった種々の改変を比較的許容しやすいと考えられる。そこで、構造可変領域にRPLKPWをタンデムにつないだ配列を、三箇所の構造可変領域それぞれに挿入した変異体(ap200、ap020、ap002)と三箇所同時に挿入した変異体(ap222)を作成した。これらの変異体はすべて野生型と同様の高次構造を形成していた。in vitroの消化により、全ての変異体からRPLKPWペプチドが派生し、派生効率は変異体の熱安定性とは相関せず、むしろ挿入した場所に依存していた。つまり、α'の構造可変領域はペプチドの導入に適していること、ペプチドの派生効率は導入したペプチドの数だけでなく、導入場所にも依存することが明らかとなった。

Yesterday's annual は ダ イ ズ タ ン パ ク mass (コ ン グ リ シ ニ ン alpha 'サ ブ ユ ニ ッ ト; alpha' below) の molecular internal に lowered blood 圧 ペ プ チ ド (RPLKPW) with column を import す る design を し, - different alpha 'の coliform 発 line now is の build を っ た. Our は and き 続 き yesterday annual made し た - different alpha 'の can の structure formation evaluation 価 を line う と に, molecular surface に lowered blood 圧 ペ プ チ ド を import し た - different alpha' を can make し, structure formation と ペ プ チ ド derived power の review 価 を line っ た. The main な result とお the following is とお とお である である. (1) the molecular internal に lowered blood 圧 ペ プ チ ド を import し た - variant の made と review 価 beta バ レ ル に position し, RPLKPW と comparison of similar し た match column を hold に つ parts, three-dimensional structure を consider し て RPLKPW match column を replacement import し た. N side ド メ イ ン の ス ト ラ ン ド A に - different を import し た alpha '(ap169) と C side ド メ イ ン の ス ト ラ ン ド D に - different を import し た alpha' (ap412) は, い ず れ も coliform 発 now is に お い て soluble で 発 now し た. し か し, ゲ ル filtration カ ラ ム に for し た と こ ろ, can fit を form し て い る こ と が Ming ら か に な っ た. Nature of wild-type と は different な る を shown し た こ と か ら, molecular internal の バ レ ル field は RPLKPW match column の import parts と し て appropriate で は な が い possibility in stopping さ れ た. (2) the molecular surface に lowered blood 圧 ペ プ チ ド を import し た - variant の made と review 価 に before Ming ら か に し た alpha 'の に in crystal structure, coordinate を decided で き な い constructs が, N - field outside the terminal part に three existing し て い た. こ の よ う な は, ア ミ ノ acid replacement や scions into と い っ た kind 々 の change - を comparison of allowable し や す い と exam え ら れ る. そ こ で, structure can be - field に RPLKPW を タ ン デ ム に つ な い だ column を, three area の structure can be - そ れ ぞ れ に scions into し た - variants (ap200 ap020 ap002) と simultaneously by three に scions into し た - variants (ap222) を made し た. The と れら <s:1> variant is すべて すべて, the wild-type と is similar to the <s:1> higher-order structure を, which forms <s:1> て た た た た た た. The in vitro の digestion に よ り, whole て の - variant か ら RPLKPW ペ プ チ ド が derived し, derived sharper rate は - variant の thermal stability と は phase masato せ ず, む し ろ scions into し た places に dependent し て い た. つ ま り, alpha 'の constructs - field は ペ プ チ ド の import に optimum し て い る こ と, ペ プ チ ド の derived sharper rate は import し た ペ プ チ ド の number だ け で な く, import, place に も dependent す る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

Nobuyuki Maruyama, Yukie Maruyama, Takahiro Tsuruki, Eiko Okuda, Masaaki Yoshikawa, Shigeru Utsumi: "Creation of soybean β-conglycinin β with strong phagocytosis-stimulating activity"Biochimica et Biophysica Acta. (In press).

Nobuyuki Maruyama、Yukie Maruyama、Takahiro Tsuruki、Eiko Okuda、Masaaki Yoshikawa、Shigeru Utsumi：“具有强吞噬刺激活性的大豆 β-伴大豆球蛋白 β 的创建”Biochimica et Biophysicala Acta（出版中）。

Nobuyuki Maruyama, Yukie Maruyama, Takahiro Tsuruki, Eiko Okuda Masaaki Yoshikawa, Shigeru Utsumi: "Creation of soybeanβ-conglycininn β with strong phagocytosis-stimulating activity"Biochimica et Biophisica Acta. 1648. 99-104 (2003)

Nobuyuki Maruyama、Yukie Maruyama、Takahiro Tsuruki、Eiko Okuda Masaaki Yoshikawa、Shigeru Utsumi：“具有强吞噬刺激活性的大豆β-伴大豆球蛋白β的创建”Biochimica et Biophisica Acta 1648. 99-104 (2003)

Yukie Maruyama, Nobuyuki Maruyama, Bunzo Mikami, Shigeru Utsumi: "Structure of the core region of the soybean β-conglycinin α' subunit"Acta Crystallographica Section D. 60. 289-297 (2004)

Yukie Maruyama、Nobuyuki Maruyama、Bunzo Mikami、Shigeru Utsumi：“大豆 β-伴大豆球蛋白 α 亚基的核心区域的结构”结晶学报第 D. 60. 289-297 部分（2004）