タンパク質工学とゼブラフィッシュ受精卵を利用したアデニン置換技術の開発

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前年度に引き続き、標的ヌクレオチド欠失技術の開発を試みた。標的ヌクレオチド欠失効率を向上させるために、Target-AID-UDGにflap endonuclease-1、トランスリージョンDNAポリメラーゼを結合させたコンストラクト（Nucleotide digger（ND））の改変を行った。Cas9タンパク質にDNA親和性を低下させるアミノ酸変異を導入し、改変型NDを作成した。これによりトランスリージョンDNAポリメラーゼがnickにアクセスしやすくなり標的ヌクレオチド欠失効率が向上することが期待される。改変型NDをコードするmRNAをゼブラフィッシュ受精卵に導入し、欠失変異が生じているかどうかを検証した。ダイレクトシークエンスを行い、得られたデータをICE analysisで解析した。その結果、アミノ酸変異が増えるほど、全体の変異に対する1ヌクレオチドの欠失変異の割合が増加した。さらに、ポリメラーゼのprocessivityを向上させることが知られているSso7dを改変型NDに付加した新たなコンストラクトを作成した。SSo7dの付加により、トランスリージョンDNAポリメラーゼのprocessivityが向上し、Cas9が作り出すnickからAPサイトまでのDNA再合成が促進されることが期待される。しかしながら、これらのコンストラクトは1ヌクレオチドの欠失変異を引き起こさなかった。一方で、ヌクレオチド置換効率が増大していたことから、Sso7dの付加によりトランスリージョンDNAポリメラーゼによるDNA再合成が阻害されてしまった可能性が考えられる。以上の結果から、NDは標的ヌクレオチドの欠失を誘導する新規な技術であり、医学・農学分野への貢献が期待される。NDによる標的ヌクレオチド欠失効果のメカニズム解明が今後の課題である。