超好熱菌のDNAリガーゼと本酵素が関与するDNA複製・修復機構に関する研究

超嗜热DNA连接酶及该酶的DNA复制和修复机制研究

• 批准号: 02J01714
• 负责人: 中谷 勝
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J01714/
• 关键词: DNAリガーゼ; 耐熱性; ATP; AMP; エントロピー; エンタルピー; 熱力学; ATP依存型; 超好熱菌; Archaea; DNA基質

超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1由来の耐熱性ATP依存型DNAリガーゼ(Tk-Lig)に着目し、本酵素の高温環境下での触媒機構について解析を行っている。平成14年度において発見されたAMP依存型DNAリガーゼ反応に対して、平成15年度においては、実験的および理論的に詳細な検討を行い、そのメカニズムについて解析した。Nicked DNAの連結反応は、吸エルゴン反応である。従って、DNAリガーゼはATPをエネルギー源として利用し、反応を進める必要がある。このことは、AMP依存型の反応は熱力学的に有り得ないことを示している。まず、反応機構について検討を行った。ATP依存型機構で見られる反応中間体をAMP依存型反応において調べたところ、全ての中間体を観察することができた。このことから、反応自体は同様の機構で進んでいることが示唆された。また、Tk-LidはATP存在下では30〜100℃の範囲で活性を示すのに対し、AMP存在下では65〜85℃の範囲でのみ活性を示した。次に、Tk-LigのAMP依存型活性の反応機構を、熱力学的側面から検討した。基質(nicked DNA)より、生成物(sealed DNA)の方が、鎖長が長い分だけ解離変性温度は高いと考えられる。即ち、高温環境下では、基質-生成物間のエネルギー準位差が、常温とは異なる可能性が考えられた。基質および生成物のカロリメトリー解析により、56〜91℃においてはエネルギーに依存しない連結反応は熱力学的にも十分有り得る、という結果が得られた。これは、AMP活性が65〜85℃の範囲でしか観察されない事実によく符合する。このAMP依存型DNAリガーゼ反応は、基質と生成物の相対的なエネルギー準位が反応温度によって変わることによって可能となる、従来例のない酵素反応の最初の報告であった。

Super hot starting the original bacterium Thermococcus kodakaraensis KOD1 origin の ATP dependent type heat DNA リ ガ ー ゼ (Tk - Lig) に し, this enzyme の under the environment of high temperature で の catalytic institutions に つ い analytical line を っ て て い る. Pp.47-53 14 year に お い て 発 see さ れ た AMP dependent type DNA リ ガ ー ゼ anti 応 に し seaborne て, pp.47-53 15 year に お い て は, be the 験 お よ び theory に detailed な beg を 検 い, そ の メ カ ニ ズ ム に つ い て parsing し た. Nicked DNA block binds to the reverse 応 応 and sucks to the reverse 応である. 従 っ て, DNA リ ガ ー ゼ は ATP を エ ネ ル ギ ー source と し て, using し 応 を into め る necessary が あ る. The に of <s:1> <s:1> と と and amp-dependent <s:1> anti応 る thermodynamics has と, which shows な と とを とを and て る る. Youdaoplaceholder0, anti-応 agency に まず て検 て検 て検 demand を bank った. ATP dependent type institutions で see ら れ る anti 応 intermediates を AMP dependent type anti 応 に お い て adjustable べ た と こ ろ, whole て の intermediates を 観 examine す る こ と が で き た. <s:1> と と ら, anti-応 self 応 similar <s:1> institutions で enter んで る る とが とが to indicate された. ま た, Tk - Lid は で in the presence of ATP は 30 ~ 100 ℃ の van 囲 を で activity in す の に し polices, the presence of AMP で は 65 ~ 85 ℃ の van 囲 で の を み activity in し た. The に, Tk-Lig <s:1> amp-dependent active <s:1> anti応 mechanism を, the side of thermodynamics ら検 ら検 discussion on <s:1> た. Matrix (DNA) nicked よ り, products (sealed) DNA の が, lock が long だ い points from - け solutions high temperature は い と exam え ら れ る. Namely ち, under the environment of high temperature で は, matrix - products の エ ネ ル ギ ー quasi differential が, room temperature と は different な る possibility が exam え ら れ た. Matrix お よ び products の カ ロ リ メ ト リ ー parsing に よ り, 56 ~ 91 ℃ に お い て は エ ネ ル ギ ー に dependent し な い link against 応 は thermodynamic に も very り る, と い う results ら が れ た. <s:1> れ する, AMP activity が65-85℃ <s:1> model 囲で 囲で 観 観 observe されな されな the facts によく conform to する. こ の AMP dependent type DNA リ ガ ー ゼ anti 応 は, matrix と products の phase of seaborne な エ ネ ル ギ ー quasi a が anti 応 temperature に よ っ て - わ る こ と に よ っ て may と な る, 従 to の な い enzyme reverse 応 の の initial report で あ っ た.

项目成果

中谷 勝, 江崎 聡, 跡見 晴幸, 今中 忠行: "Substrate recognition and fidelity of strand joining by an archaeal DNA ligase"European Journal of Biochemistry. 269. 650-656 (2002)

Masaru Nakatani、Satoshi Ezaki、Haruyuki Atomi、Tadayuki Imanaka：“古细菌 DNA 连接酶的底物识别和链连接保真度”欧洲生物化学杂志 269. 650-656 (2002)。