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酸性条件下で耐熱性を示すGH19型キチナーゼの構造解析と抗真菌酵素製剤の開発

酸性条件下耐热的GH19型几丁质酶的结构分析及抗真菌酶制剂的开发

基本信息

批准号：
22K05423
负责人：
矢野成和
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05423/
关键词：
キチナーゼ耐熱性抗真菌

项目摘要

Lysobacter enzymogenes MK9-1由来のGH19キチナーゼChi19MKは、抗真菌活性を有する酵素であり、Trichoderma reeseiの生育を強力に阻害する。また、pH 1 - 4.5の範囲で優れた熱安定性を示し、pH 4.0の緩衝液中で、5時間、80℃で処理しても活性を保持する。本酵素は、キチン結合ドメインと触媒ドメインから構成されており、本酵素の熱安定性に関わる構造的特徴を調べるために、結合ドメインを欠失させた変異酵素（Chi19MKcat）の作製を行なった。CDスペクトル解析の結果、Chi19MKcatの安定性は若干低下するが、野生型酵素と同様に、加熱することで二次構造の変化がみられ、冷却することで二次構造がもとに戻った。また、加熱処理後のChi19MKcatは、T.reeseiの菌糸の生育阻害活性を維持していた。同様のCDスペクトル解析を細菌に由来する2種類のGH19型酵素について検討したが、加熱後に冷却しても二次構造がもとに戻らなかった。この結果から、Chi19MKの触媒ドメインは、他の細菌由来GH19キチナーゼとは異なり、熱変性後にリフォールディングすることが示唆された。Chi19MKの触媒ドメインが、他のGH19キチナーゼと異なる立体構造を有するのかを調べるために、Chi19MKcatを用いて結晶化を試みた。各種条件をスクリーニングすることで得た単結晶について、X線結晶構造解析を行ったところ、分解能2.7Åで結晶構造が決定した。現在、得られたChi19MKcatの立体構造と既知酵素の立体構造を比較し、異なる構造を有する箇所に変異を導入している。

Lysobacter zymogenes MK9-1 is derived from GH19 and Chi19MK. It has antifungal activity and is a potent fertility inhibitor. Excellent thermal stability in pH 1 - 4.5 range, pH 4.0 buffer solution, 5 time, 80℃ treatment, activity maintained. The enzyme is composed of two parts: one part is composed of two parts, the other part is composed of three parts, the other part is composed of two parts, the other part is composed of three parts, the other parts, the other part is composed of three parts, the other parts is composed of three parts, the other parts, the CD analysis results, Chi19 MKcat stability is somewhat lower, wild-type enzyme and homology, heating, secondary structure transformation, cooling, secondary structure transformation, and so on. After heat treatment, the growth inhibition activity of Chi19MKcat was maintained. For the same reason, the analysis of CD molecules and GH19-type enzymes in bacteria is carried out in the middle of the study, and after heating, the secondary structure is cooled. The results show that Chi19MK is a catalyst for growth of other bacteria. Chi19 MK catalyst and other GH19 MKcat products have been successfully crystallized. The crystal structure can be determined by X-ray crystal structure analysis and decomposition energy of 2.7 ℃ under various conditions. Now, we can compare the three-dimensional structure of Chi19MKcat with that of known enzyme, and introduce different structures into it.