酸性条件下で耐熱性を示すGH19型キチナーゼの構造解析と抗真菌酵素製剤の開発

Lysobacter enzymogenes MK9-1由来のGH19キチナーゼChi19MKは、抗真菌活性を有する酵素であり、Trichoderma reeseiの生育を強力に阻害する。また、pH 1 - 4.5の範囲で優れた熱安定性を示し、pH 4.0の緩衝液中で、5時間、80℃で処理しても活性を保持する。本酵素は、キチン結合ドメインと触媒ドメインから構成されており、本酵素の熱安定性に関わる構造的特徴を調べるために、結合ドメインを欠失させた変異酵素（Chi19MKcat）の作製を行なった。CDスペクトル解析の結果、Chi19MKcatの安定性は若干低下するが、野生型酵素と同様に、加熱することで二次構造の変化がみられ、冷却することで二次構造がもとに戻った。また、加熱処理後のChi19MKcatは、T.reeseiの菌糸の生育阻害活性を維持していた。同様のCDスペクトル解析を細菌に由来する2種類のGH19型酵素について検討したが、加熱後に冷却しても二次構造がもとに戻らなかった。この結果から、Chi19MKの触媒ドメインは、他の細菌由来GH19キチナーゼとは異なり、熱変性後にリフォールディングすることが示唆された。Chi19MKの触媒ドメインが、他のGH19キチナーゼと異なる立体構造を有するのかを調べるために、Chi19MKcatを用いて結晶化を試みた。各種条件をスクリーニングすることで得た単結晶について、X線結晶構造解析を行ったところ、分解能2.7Åで結晶構造が決定した。現在、得られたChi19MKcatの立体構造と既知酵素の立体構造を比較し、異なる構造を有する箇所に変異を導入している。

Lysobacter enzymogenes MK9-1由来のGH19キチナーゼChi19MKは、抗真菌活性を有する酵素であり、Trichoderma reeseiの生育を強力に阻害する。また、pH 1 - 4.5の範囲で優れた熱安定性を示し、pH 4.0の緩衝液中で、5時間、80℃で処理しても活性を保持する。本酵素は、キチン結合ドメインと触媒ドメインから構成されており、本酵素の熱安定性に関わる構造的特徴を調べるために、結合ドメインを欠失させた変異酵素（Chi19MKcat）の作製を行なった。CDスペクトル解析の結果、Chi19MKcatの安定性は若干低下するが、野生型酵素と同様に、加熱することで二次構造の変化がみられ、冷却することで二次構造がもとに戻った。また、加熱処理後のChi19MKcatは、T.reeseiの菌糸の生育阻害活性を維持していた。同様のCDスペクトル解析を細菌に由来する2種類のGH19型酵素について検討したが、加熱後に冷却しても二次構造がもとに戻らなかった。この結果から、Chi19MKの触媒ドメインは、他の細菌由来GH19キチナーゼとは異なり、熱変性後にリフォールディングすることが示唆された。Chi19MKの触媒ドメインが、他のGH19キチナーゼと異なる立体構造を有するのかを調べるために、Chi19MKcatを用いて結晶化を試みた。各種条件をスクリーニングすることで得た単結晶について、X線結晶構造解析を行ったところ、分解能2.7Åで結晶構造が決定した。現在、得られたChi19MKcatの立体構造と既知酵素の立体構造を比較し、異なる構造を有する箇所に変異を導入している。