4倍性魚種コイのc-myc遺伝子2タイプの進化

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コイc-myc遺伝子の細胞レベルでの機能を明らかにするためには抗体を用いた実験が必須であるが、相同性の高い2つのc-Mycを区別できる抗体を作製することは困難である。そこで、それそれのc-myc遺伝子にFLAGエピトープタグを付加してコイ上皮腫由来の培養細胞株EPCにトランスフェクションし、400-μg/mlG418を含むMEMで培養したところ、c-mycを恒常的に発現する株を得ることかできた。この株を用いることにより、Anti-FLAG抗体を使った免疫沈降やChIPアッセイなどを可能にしただけでなく、細胞増殖や老化など長期にわたる解析も可能となった。進化速度が速く新しい機能を持っているであろうと推測されるc-Myc1蛋白質の解析をおこなうため、大腸菌による組換え蛋白質の合成を試みた。c-mycのcDNAをpETベクターに挿入し、大腸菌Rosetta(DE3)株を形質転換し、GST融合蛋白質を発現させることに成功した。この蛋白質を用いることにより、c-Myc1の新規結合蛋白質のスクリーニングか可能となった。コイc-myc遺伝子の個体レベルでの解析は、これまでRT-PCRでの発現解析のみであった。本研究では、どの組織のどの細胞でc-myc遺伝子が発現しているかを詳細に明らかにするために、10%中性ホルマリンで灌流固定したコイの各臓器の組織切片を作製しin situハイブリダイゼーションをおこなった。2種類のc-mycに共通な領域をプローブとして用いたところ、脳のダリア細胞と大型神経細胞、鯛の上皮細胞で強い発現が観察され、肝膵臓の膵細胞でも弱い発現が認められた。今回、2種類のc-mycを特異的に見分けられるように設計したオリコヌクレオチドプローブでは感度が低く、シグナルを検出することはできなかったが、個体レベルでの機能を推定する上では重要な知見を得ることかできた。