魚類には「ない」遺伝子の導入による魚類由来培養細胞株の老化耐性メカニズムの解明

哺乳類では，癌遺伝子産物Rasはp53経路とp16経路の両方を活性化することで細胞老化を誘導する。魚類はp16を欠如しているため，Rasの活性化のみでは魚類細胞は完全老化に成熟できない。そこで本研究では，魚類には「ない」p16遺伝子とras遺伝子を魚類由来培養細胞株EPCに共導入し，完全老化誘導を試みることで，その老化耐性メカニズムを解明することを目的とした。ヒトp16を単独でトランスフェクションしたEPC細胞において，細胞老化マーカーであるSA-β-gal活性の上昇と，SASP（細胞老化随伴分泌現象）因子をコードする遺伝子（il1b，il6，cxcl8a）の発現上昇が確認された。申請前に行った予備実験では，p16を単独で導入した細胞ではSASP因子の発現上昇は確認できなかったが，これは，選択用抗生物質G418によるセレクションが行われていなかったため，一過性の導入ではp16を発現する細胞が少なかったことが理由であると推察された。次に，市販のバイシストロン性発現プラスミドベクター（pIRES）およびバイディレクショナル発現ベクター（pBI）を用いてp16 とドミナントネガティブ変異体Ras（RasN17）を同一プラスミドから翻訳させるシステムの構築を試みた。その結果，魚類細胞ではIRESは機能せず，ColE1 oriを持つpBIはpUC oriを持つpIRESに比べてコピー数が少なく，トランスフェクションに十分な量のプラスミドを抽出できなかった。少なくとも魚類のゲノムにp16が存在しないことが魚類の細胞株が完全老化に対して耐性をもつことの重要な決定要因の一つではあるものの，p16によって誘導される完全老化にRasの活性化が必要どうかについては明らかにできなかった。

哺乳類では，癌遺伝子産物Rasはp53経路とp16経路の両方を活性化することで細胞老化を誘導する。魚類はp16を欠如しているため，Rasの活性化のみでは魚類細胞は完全老化に成熟できない。そこで本研究では，魚類には「ない」p16遺伝子とras遺伝子を魚類由来培養細胞株EPCに共導入し，完全老化誘導を試みることで，その老化耐性メカニズムを解明することを目的とした。ヒトp16を単独でトランスフェクションしたEPC細胞において，細胞老化マーカーであるSA-β-gal活性の上昇と，SASP（細胞老化随伴分泌現象）因子をコードする遺伝子（il1b，il6，cxcl8a）の発現上昇が確認された。申請前に行った予備実験では，p16を単独で導入した細胞ではSASP因子の発現上昇は確認できなかったが，これは，選択用抗生物質G418によるセレクションが行われていなかったため，一過性の導入ではp16を発現する細胞が少なかったことが理由であると推察された。次に，市販のバイシストロン性発現プラスミドベクター（pIRES）およびバイディレクショナル発現ベクター（pBI）を用いてp16 とドミナントネガティブ変異体Ras（RasN17）を同一プラスミドから翻訳させるシステムの構築を試みた。その結果，魚類細胞ではIRESは機能せず，ColE1 oriを持つpBIはpUC oriを持つpIRESに比べてコピー数が少なく，トランスフェクションに十分な量のプラスミドを抽出できなかった。少なくとも魚類のゲノムにp16が存在しないことが魚類の細胞株が完全老化に対して耐性をもつことの重要な決定要因の一つではあるものの，p16によって誘導される完全老化にRasの活性化が必要どうかについては明らかにできなかった。