シグナル伝達分子活性化の1分子イメージングによる細胞内情報伝達機構の解明

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低分子量Gタンパク質Rasの細胞膜上での運動と活性化を1分子可視化した。まず、全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きている培養細胞中に発現させたGFP-H-Ras分子を1分子可視化した。H-Ras分子は、細胞膜上でリン脂質並みに速い拡散運動をしていた。つまり、定常状態では、ほとんどのH-Rasが安定なラフトに入っているわけではないことが示された。次に、活性化したH-Ras分子を生細胞中で可視化する方法を開発した。すなわち、YFP-H-Ras発現細胞にAlexa594標識したRBD(Raf-1のRas binding domain)を顕微注入し、YFPからAlexaへの蛍光共鳴エネルギー移動を1分子観察した(1分子FRET)。幹細胞因子(SCF)刺激をすると、1分子FRETの輝点が多数観察された。しかし、この各輝点の寿命は非常に短く、0.67秒以下のものが殆どであった。FRET輝点の個数は、刺激後3-4分に顕著に増加し、生化学的解析による活性の時間変化と一致した。すなわち、通常の生化学的計測や画像解析で見られる活性曲線は、各分子のパルス状の活性化の合計を見ているものと考えられる。さらに、FRETを起こしている間、分子ペアは殆ど運動を停止していた。また、刺激後3-4分に細胞膜上に現れるGFP-Raf-1の輝点も静止していた。このような、活性化されたRas分子の一時停留は、上流や下流のシグナル分子との結合によるものではなく、また、カベオラ/ラフトにも依存しなかった。ところが、活性化Rasのスキャッフォールディングタンパク質SUR-8は、一時停留を促進した。これは、Rasが活性化されると、SUR-8などのスキャッフォールディングタンパク質の結合により、シグナル伝達のための大きな活性化Ras分子複合体が協同的に形成されること、そこで下流分子にシグナルが伝達され、その後、複合体はすぐに分解されること、Rasシグナルは、エフェクターとのランダムな衝突だけで伝わるのではないこと、を示唆している。