DNA複製マシンによる複製開始フィードバック制御の分子機構

DNA复制机复制起始反馈控制的分子机制

基本信息

  • 批准号:
    02J09038
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.64万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2002 至 2003
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

当研究室では、大腸菌染色体の複製開始蛋白質DnaAに結合したATPの水解により、DnaAの不活化を導く機構、RIDA(Regulatory Inactivation of DnaA)を見出している。RIDAに8は、DNAポリメラーゼIIIβサブユニットがDNAにロードされ、βクランプを形成することが必要である。よって、複製装置にはフィードバック的に、複製開始を抑制するという概念が提唱される。最近、RIDAに必須な新奇蛋白質Hdaが同定され、RIDA構成因子が出揃った。そこで本研究では、Hisタグ融合型としてHdaを精製し、RIDA反応を生化学的に解析した。まず、RIDA再構成系(DNAにロードされたβクランプをゲル濾過により単離し、これを用いてHdaに依存したDnaA結合性ATPの加水分解を行う)を構築し解析した結果、HdaはADP結合により活性型となることが示唆された。実際、フィルターバインディング法により、HdaはADPに高い特異性を持って結合することがわかった(Kd値、約2μM)。次に、βクランプ・Hda・DnaAの3者の相互作用について検討した。まず、プルダウン法により、βサブユニットはHdaと直接結合することがわかった。さらに、ゲル濾過による解析から、DNAにロードさせたβサブユニット(βクランプ)はHdaおよびATP結合型DnaAにそれぞれ単独で結合することが見出された。よって、βクランプを足場にしてHdaとATP-DnaAが相互作用する可能性が示唆される。このときHdaがDnaA結合性ATPに作用し、その加水分解を促しているのかもしれない。DnaAおよびHdaはともにAAA+型ATPase蛋白質であるが、一部のAAA+蛋白質については、複合体を形成し、分子間の境界でATP加水分解を行うことが提唱されている。RIDAの分子機構もこれと矛盾しないと思われる。
When laboratory で は, coliform chromosome の duplicate DnaA protein に combining し た ATP hydrolysis の に よ り, DnaA の inactive を く institutions, RIDA (Regulatory Inactivation of DnaA) を shows し て い る. RIDA に 8 は, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ III beta サ ブ ユ ニ ッ ト が DNA に ロ ー ド さ れ, beta ク ラ ン プ を form す る こ と が necessary で あ る. よ っ て, reproduction device に は フ ィ ー ド バ ッ ク に, duplicate を inhibiting す る と い う concept が mention sing さ れ る. Recently, RIDAに must な identify the novel protein Hdaが され, and RIDA constituent factors が emerge 揃った. そ こ で this study で は, ihs タ グ fusion type と し て Hda を refined し, RIDA 応 を に of biochemistry analytic し た. ま ず, RIDA to constitute a system (DNA に ロ ー ド さ れ た beta ク ラ ン プ を ゲ ル filtration に よ り 単 し, こ れ を with い て Hda に dependent し た DnaA associativity の ATP hydrolysis を line う) を build し parsing し た results, Hda は ADP combining に よ り activity type と な る こ と が in stopping さ れ た. Be international, フ ィ ル タ ー バ イ ン デ ィ ン グ method に よ り, Hda は ADP に high い specificity を holding っ て combining す る こ と が わ か っ た (Kd numerical, about 2 microns). The <s:1> of に, β ラ ラ プ プ · Hda · DnaA <s:1> interacts に て検 て検 て検 to seek た. ま ず, プ ル ダ ウ ン method に よ り, beta サ ブ ユ ニ ッ ト は Hda と directly combined す る こ と が わ か っ た. さ ら に, ゲ ル filtration に よ る parsing か ら, DNA に ロ ー ド さ せ た beta サ ブ ユ ニ ッ ト (beta ク ラ ン プ) は Hda お よ び ATP combination type DnaA に そ れ ぞ れ 単 alone で combining す る こ と が shows さ れ た. よ っ て, beta ク ラ ン プ を foot field に し て Hda と ATP - DnaA が interaction す が る possibility in stopping さ れ る. <s:1> と と に HdaがDnaA binding ATPに effect <s:1> そ <s:1> water addition decomposition を promotes て て る る る れな そ が そ れな れな れな れな て て る を そ れな れな れな れな れな れな れな れな DnaA お よ び Hda は と も に type AAA + ATPase protein で あ る が, a の AAA + protein に つ い て は, complex を し, intermolecular の realm で ATP hydrolysis を line う こ と が mention sing さ れ て い る. RIDA <s:1> molecular structure れと れと contradiction な と と thought われる.

项目成果

期刊论文数量(2)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Takayuki Obita, Takafumi Iwata, Masayuki Suetsugu, Yoichiro Yoshida, Yoshitsugu Tanaka, Tsutomu Katayama, Tadashi Ueda, Taiji Imoto: "Determination of the secondary structure in solution of the scherichia coli DnaA DNA-binding domain"Biochemical and Bioph
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Masayuki Suetsugu, Hironori Kawakami, Kenji Kurokawa, Toshio Kubota, Makoto Takata, Tsutomu Katayama: "DNA replication-coupled inactivation of DnaA protein in vitro a role for DnaA arginine-334 of the AAA+ Box VIII motif in ATP hydrolysis"Molecular Microb
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