開始のオン・オフにより周期的に複製を行う大腸菌ミニ染色体複製サイクルの再構成

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染色体複製の開始は細胞周期進行と連動して周期的に制御されている。大腸菌では、染色体複製起点を持つプラスミドDNAを鋳型とし、精製蛋白質を用いて染色体複製を再構成できる(ミニ染色体複製系)。複製開始反応は開始蛋白質DnaAのATP結合型(活性型)とADP結合型(不活性型)の変換によって制御されている。ATP-DnaAはRIDAという複製伸長反応と共役したDnaA結合性ATP加水分解機構によってADP-DnaAに変換される(不活性化システム)。またin vitroにおいては、特異的なDNA配列DARSによって、DnaA結合性ADPが解離し、ATP再結合が促されることが見いだされている(再活性化システム)。本研究では、開始のオン・オフによりコントロールされた複製サイクル系の再構成を目指すべく、不活性化システムの試験管内再構成系を確立した。この再構成系にはクランプと呼ばれるDNAポリメラーゼIII複合体のサブユニットとHdaタンパク質が必要である。不活性化システム再構成系を用いた解析から、ヌクレオチド結合によって促されるHdaの多量体構造の変換が、不活性化システムの発動に必要であることを見いだした。このHdaヌクレオチド結合は細胞内においてもDnaA活性制御に重要であった。さらに我々は、DARSが細胞内において再活性化に重要な機能を果たしていることを示し、DARS活性を調節する新規活性を見いだした。これらの結果は複製開始のオン・オフを制御する分子メカニズムを示唆するものであり、その周期性を再構成する上で重要な知見を提供するものである。