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ニガウリ種子ウリジン特異性リボヌクレアーゼMC1の構造と基質特異性に関する研究

苦瓜籽尿苷特异性核糖核酸酶MC1的结构及底物特异性研究

基本信息

批准号：
02J09157
负责人：
沼田倫征
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.グアノシンに対して高い基質特異性を獲得した2つのRNase MC1変異体(N71TとN71S)の結晶構造を決定し、基質特異性の改変メカニズムを検討した。まず、各変異体と基質類似体であるGMP(グアノシン一リン酸)との複合体の結晶を作製し、分子置換法によりそれらの結晶構造を1.6Åの分解能で決定した。その結果、両変異体とも基質結合部位において特異的にグアニンと相互作用していることが明かとなった。両変異体の基質結合様式はお互い非常に類似しており、Leu73とPhe80の側鎖によるグアニンとの疎水的相互作用、さらに、Gln9と変異を導入した71位のアミノ酸残基(Thr71およびser71)の側鎖および水分子を介したグアニンとの水素結合のネットワークが確認された。野生型RNase MC1と変異体の塩基結合様式を比較した結果、Asn71を側鎖の短いThrもしくはSerに置換することで基質結合部位が拡張し、ウラシルより大きなグアニンの挿入が可能になることが明かとなった。さらに、上記のようにグアニンは変異体タンパクおよび水分子と高度に水素結合を形成しており、この水素結合のネットワークが変異体のグアニン特異性に大きく関与していることを示唆した。2.RNase Pは前駆体tRNA(pre-tRNA)の5'リーダー配列を除去するリボ核タンパク質であり、全ての生物に普遍的に存在する酵素である。本研究では、古細菌Pyrocccus horikoshii由来RNase Pのタンパク質サブユニットの一つであるPh1771pの構造機能相関を検討するため、その結晶構造を2.0Åの分解能で決定した。Ph1771pのフォールディングは、六つのストランドから成る逆平行βシート(βバレル構造)とそれに付随したヘリックス構造から形成されていたPh1771pのβバレル構造は、これまでに立体構造が決定しているいくつかのRNA結合タンパク質と非常に類似していることが明かとなった。しかし、Ph1771pのアミノ酸配列はこれらRNA結合タンパク質とほとんど相同性が無いことから、これらが共通の祖先型RNA結合タンパク質から進化したことが推定された。Ph1771pの分子表面には極めて塩基性に富む領域が存在しており、この領域がRNase P RNAもしくはpre-tRNAと相互作用していることが推定された。この塩基性領域に存在する保存されたアルギニン残基をアラニンに置換した結果、RNase Pの活性が著しく低下することからも、この塩基性領域がPh1771pの機能に重要な役割を果たしていることが示唆された。

1. The crystal structure of RNase MC1 variant (N71T and N71S) was determined and the change of matrix specificity was discussed. The crystal structure of the complex was determined by molecular replacement method and the decomposition energy of 1.6 ℃. The result is that the binding sites of allogeneic substances are not specific. The matrix binding formula of the heterogeneic group is very similar to that of Leu73 and Phe80, and the interaction between Leu73 and Phe80 and Phe80 is very similar to that of Gln9. The heterogeneic group is introduced into the 71-position acid residue (Thr71 and Ser71), and the side lock of Leu 73 and Phe 80 is very similar to that of Phe 80. Comparison of wild-type RNase MC1 and heterogeneic matrix binding patterns shows that Asn71 has a side-lock and a short Thr and Ser substitution, and that the matrix binding site is open and closed. In addition, the above notes indicate that water molecules are highly bound to water molecules, and that water molecules are bound to water molecules. 2. RNase P is the precursor tRNA(pre-tRNA) of the 5'-chain reaction. In this study, the origin of Pyroccus horikoshii from RNase P was determined by the structural and functional correlation of Ph1771p and its crystal structure. Ph1771p's β-structure, which is similar to Ph1771p's β-structure, determines the stereostructure and RNA binding properties. Ph 1771p is a common ancestral RNA binding sequence. The molecular surface of Ph 1771p is extremely basic and rich in domains, and this domain is presumed to be dominated by RNase P RNA and pre-tRNA interactions. The existence of this basic domain is a result of the replacement of the Ph 1771p residue and the decrease in RNase P activity.