ニガウリ種子ウリジン特異性リボヌクレアーゼMC1の構造と基質特異性に関する研究

苦瓜籽尿苷特异性核糖核酸酶MC1的结构及底物特异性研究

基本信息

批准号：
02J09157
负责人：
沼田倫征
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.グアノシンに対して高い基質特異性を獲得した2つのRNase MC1変異体(N71TとN71S)の結晶構造を決定し、基質特異性の改変メカニズムを検討した。まず、各変異体と基質類似体であるGMP(グアノシン一リン酸)との複合体の結晶を作製し、分子置換法によりそれらの結晶構造を1.6Åの分解能で決定した。その結果、両変異体とも基質結合部位において特異的にグアニンと相互作用していることが明かとなった。両変異体の基質結合様式はお互い非常に類似しており、Leu73とPhe80の側鎖によるグアニンとの疎水的相互作用、さらに、Gln9と変異を導入した71位のアミノ酸残基(Thr71およびser71)の側鎖および水分子を介したグアニンとの水素結合のネットワークが確認された。野生型RNase MC1と変異体の塩基結合様式を比較した結果、Asn71を側鎖の短いThrもしくはSerに置換することで基質結合部位が拡張し、ウラシルより大きなグアニンの挿入が可能になることが明かとなった。さらに、上記のようにグアニンは変異体タンパクおよび水分子と高度に水素結合を形成しており、この水素結合のネットワークが変異体のグアニン特異性に大きく関与していることを示唆した。2.RNase Pは前駆体tRNA(pre-tRNA)の5'リーダー配列を除去するリボ核タンパク質であり、全ての生物に普遍的に存在する酵素である。本研究では、古細菌Pyrocccus horikoshii由来RNase Pのタンパク質サブユニットの一つであるPh1771pの構造機能相関を検討するため、その結晶構造を2.0Åの分解能で決定した。Ph1771pのフォールディングは、六つのストランドから成る逆平行βシート(βバレル構造)とそれに付随したヘリックス構造から形成されていたPh1771pのβバレル構造は、これまでに立体構造が決定しているいくつかのRNA結合タンパク質と非常に類似していることが明かとなった。しかし、Ph1771pのアミノ酸配列はこれらRNA結合タンパク質とほとんど相同性が無いことから、これらが共通の祖先型RNA結合タンパク質から進化したことが推定された。Ph1771pの分子表面には極めて塩基性に富む領域が存在しており、この領域がRNase P RNAもしくはpre-tRNAと相互作用していることが推定された。この塩基性領域に存在する保存されたアルギニン残基をアラニンに置換した結果、RNase Pの活性が著しく低下することからも、この塩基性領域がPh1771pの機能に重要な役割を果たしていることが示唆された。

1。确定了两个RNase MC1突变体（N71T和N71S）的晶体结构，这些晶体对鸟嘌呤的底物特异性获得了高底物特异性，并研究了底物特异性改变的机制。首先，制备了每个突变体和底物类似GMP（鸟苷单磷酸）的络合物的晶体，并以1.6Å分辨率通过分子置换来确定其晶体结构。结果，据揭示了两个突变体在底物结合位点特异性与鸟嘌呤相互作用。两个突变体的底物结合模式非常相似，证实了Leu73和Phe80的侧链之间的鸟嘌呤之间的疏水相互作用，以及通过位置71（THR71和SER71）的氨基酸残基的侧链与鸟嘌呤键合的氢结合网络，从而通过突变和水中引入了突变。比较野生型RNase MC1的碱基结合模式和突变体的表明，用短侧链THR或SER代替ASN71会扩展底物结合位点，从而可以插入大于Uracil的鸟嘌呤。此外，如上所述，鸟嘌呤与突变蛋白和水分子形成高度氢键，这表明该氢键网络与突变体的鸟嘌呤特异性很大程度上涉及。 2。RNaseP是一种核糖核蛋白，可去除前体tRNA（前tRNA）的5'领导者序列，并且是一种在所有生物体中普遍存在的酶。在这项研究中，我们研究了PH1771P的结构功能相关性，PH1771P是来自古细菌pyroccus horikoshii的RNase P的蛋白质亚基之一，并以2.0Å的分辨率确定了其晶体结构。已经揭示了PH1771p的折叠与几种RNA结合蛋白非常相似，这些蛋白是由截至迄今为止由六个链和相关的螺旋结构组成的反平行β-折叠（β-桶结构）形成的。但是，PH1771p的氨基酸序列与这些RNA结合蛋白的同源性很小，这表明它们是从共同的祖先RNA结合蛋白中演变而来的。 pH1771p的表面上有一个非常基本的区域，并且假定该区域与RNase P RNA或Pre-tRNA相互作用。替代存在于该基本区域中丙氨酸的保守精氨酸残基可显着降低RNase P的活性，这表明该基本区域在PH1771p的功能中起重要作用。