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光合成細菌由来炭酸固定経路である還元的TCA回路の分子生物学的解析

还原 TCA 循环（源自光合细菌的二氧化碳固定途径）的分子生物学分析

基本信息

批准号：
13750735
负责人：
福居俊昭
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

還元的TCA回路は有機酸を代謝系の中心とした非Calvin回路型のCO_2固定系の一つであり、TCA回路の逆回転により4分子のCO_2から1分子のオキサロ酢酸を生成する。しかし、本回路におけるそれぞれの酵素的性質や反応機構の解析、遺伝子クローニングはこれまで詳しく行われていない。本研究は湖水より単離した緑色硫黄細菌Chlorobium limicola由来還元的TCAによるCO_2固定を分子レベルで明らかにすることを目的とした。ATP-citrate lyase(ACL)はATPを用いてクエン酸をオキサロ酢酸とアセチルCoAに開裂する逆クライゼン反応を触媒する興味深い酵素であり、原核生物では還元的TCA回路を有する生物にのみ存在している。我々はC. limicola由来ACL遺伝子のクローニングと異種宿主発現を行い、本酵素が真核生物由来酵素と異なるαβヘテロ構造を有していることを明らかにした。本酵素は逆反応を触媒せず、またADPによる競争阻害や、基質であるクエン酸濃度に応じた負の協同性を示し、回路の回転を制御していることを見出した。また[γ-^<32>P]ATPを用いた反応機構の検討により、本酵素のα-サブユニット中のHis273が自己リン酸化され、ついでリン酸基のクエン酸への転移とCoAとの結合によって生じたシトリル-CoAが開裂してオキサロ酢酸とアセチルCoAが生成することを示した。さらに、ADPは自己リン酸化された酵素と可逆的に反応してATPを再生することにより競争的に酵素反応を阻害することを示した。一方で、本菌ゲノムにはTCA回路の鍵酵素であるcitrate synthase(CS)の相同遺伝子が存在することを見いだした。CSは還元的TCA回路によるCO_2固定を阻害すると予想されることから、その発現および発現産物について検討した。本遺伝子産物は大腸菌由来CSと45%の相同性を示し、その組換え型酵素は確かにCS活性を示した。さらに本菌において本遺伝子が転写・翻訳されていることを見いだした。酵素的性質について検討したところ、本酵素はAMPおよびADPによって強く活性化されたことから、細胞内のエネルギー状態に応じた還元的TCA回路/TCA回路の方向や速度の調節に機能していることが推測された。また、CO_2固定酵素の一つであるisocitrate dehydrogenaseの遺伝子クローニングおよび生化学的解析を行った。本酵素は、多くの生物に存在するダイマー型とは異なるモノマー型酵素であり、中性付近では脱炭酸活性と同程度の炭酸固定活性を示すこと、オキサロ酢酸によって競争阻害を受けることを明らかとした。

The restored TCA loop is the center of the organic acid metabolism system and the non-Calvin loop type CO_2 fixed system.つであり、TCA circuit's reverse return 転により4 molecules of CO_2から1 molecule of のオキサロ酢 acid を generates する. The nature of the enzyme in this circuit and the nature of the enzyme is the reaction mechanism. Analysis, remaining 伝子クローニングはこれまで detailed しく行われていない. In this study, the purpose of this study was to use the TCA-based CO_2-fixed molecule that was isolated from the green sulfur bacteria Chlorobium limicola derived from the lake water. ATP-citrate lyase(ACL)はATPを Used いてクエン acid をオキサロ酢lic acid とアセチルCoAに开する inverse クライゼThe reaction catalyst, the interesting enzyme, and the TCA circuit that restores the prokaryotic organism are the existence and existence of the organism. I々はC. Origin of limicola The enzyme is derived from eukaryotes and is an αβ enzyme. This enzyme is a reverse reaction catalyst, a competitive inhibitor of ADP, and a substrate. The acid concentration is the same as the negative synergy, and the loop control is the control.また[γ-^<32>P]ATPを Use the いたanti-reaction mechanism の検同により、Honenzyme His273's own リン acidified され、ついでリンAcid-based acid への転movable とCoA との combined によって生じたシトリル-CがAが cracking してオキサロ酢 acid とアセチルCoAが generates することをshows した.さらに、ADPはリンacidifying されたenzyme and reversible にreaction してAT The Pをregenerating enzyme reacts with the enzyme that competes with the enzyme that inhibits the enzyme reaction. On the one hand, the key enzyme of the TCA circuit of this bacterium is the citrate synthase (CS), which is the same as the remaining enzyme. The TCA loop of the CS is restored and the CO_2 is fixed and blocked. This genetic product has a coliform origin CS, a 45% identity, and a group-replacement type enzyme, and has a confirmed CS activity.さらに本草において本缝子が転WRITE・Translation訳されていることを见いだした. The nature of the enzyme is as follows: This enzyme is active as AMP, ADP is strong and active, and it is intracellular The state of the TCA circuit and the direction and speed of the TCA circuit are restored and the function of the adjustment function is speculated.また、CO_2 fixed enzymeの一つであるisocitrate dehydrogenaseの伝子クローニングおよびbiochemical analysisを行った. This enzyme is a multi-organism type enzyme, a neutral type enzyme, and a neutral close-to-neutral decarbonization activity. The carbonic acid fixation activity of the same degree of sex and the competition between the carbonic acid fixation activity and the carbonic acid anhydride are hindered by competition.