权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

光合成細菌由来炭酸固定経路である還元的TCA回路の分子生物学的解析

还原 TCA 循环（源自光合细菌的二氧化碳固定途径）的分子生物学分析

基本信息

批准号：
13750735
负责人：
福居俊昭
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

還元的TCA回路は有機酸を代謝系の中心とした非Calvin回路型のCO_2固定系の一つであり、TCA回路の逆回転により4分子のCO_2から1分子のオキサロ酢酸を生成する。しかし、本回路におけるそれぞれの酵素的性質や反応機構の解析、遺伝子クローニングはこれまで詳しく行われていない。本研究は湖水より単離した緑色硫黄細菌Chlorobium limicola由来還元的TCAによるCO_2固定を分子レベルで明らかにすることを目的とした。ATP-citrate lyase(ACL)はATPを用いてクエン酸をオキサロ酢酸とアセチルCoAに開裂する逆クライゼン反応を触媒する興味深い酵素であり、原核生物では還元的TCA回路を有する生物にのみ存在している。我々はC. limicola由来ACL遺伝子のクローニングと異種宿主発現を行い、本酵素が真核生物由来酵素と異なるαβヘテロ構造を有していることを明らかにした。本酵素は逆反応を触媒せず、またADPによる競争阻害や、基質であるクエン酸濃度に応じた負の協同性を示し、回路の回転を制御していることを見出した。また[γ-^<32>P]ATPを用いた反応機構の検討により、本酵素のα-サブユニット中のHis273が自己リン酸化され、ついでリン酸基のクエン酸への転移とCoAとの結合によって生じたシトリル-CoAが開裂してオキサロ酢酸とアセチルCoAが生成することを示した。さらに、ADPは自己リン酸化された酵素と可逆的に反応してATPを再生することにより競争的に酵素反応を阻害することを示した。一方で、本菌ゲノムにはTCA回路の鍵酵素であるcitrate synthase(CS)の相同遺伝子が存在することを見いだした。CSは還元的TCA回路によるCO_2固定を阻害すると予想されることから、その発現および発現産物について検討した。本遺伝子産物は大腸菌由来CSと45%の相同性を示し、その組換え型酵素は確かにCS活性を示した。さらに本菌において本遺伝子が転写・翻訳されていることを見いだした。酵素的性質について検討したところ、本酵素はAMPおよびADPによって強く活性化されたことから、細胞内のエネルギー状態に応じた還元的TCA回路/TCA回路の方向や速度の調節に機能していることが推測された。また、CO_2固定酵素の一つであるisocitrate dehydrogenaseの遺伝子クローニングおよび生化学的解析を行った。本酵素は、多くの生物に存在するダイマー型とは異なるモノマー型酵素であり、中性付近では脱炭酸活性と同程度の炭酸固定活性を示すこと、オキサロ酢酸によって競争阻害を受けることを明らかとした。

The central part of the organic acid metabolism system in the TCA loop is not a Calvin loop type CO_2 fixation system. The reverse part of the TCA loop is a CO_2 fixation system in which four molecules of CO_2 are produced. The nature of the enzyme in the loop, the analysis of the reaction mechanism, and the details of the enzyme in the loop This study is aimed at reducing the molecular weight of CO_2 by Chlorobium licola, a green sulfur bacterium. ATP-citrate lyase(ACL) is an enzyme that catalyzes ATP cleavage, acid cleavage, and CoA cleavage. It is also an enzyme that exists in the TCA loop of prokaryotes. I am C. Limicola is derived from the ACL gene, and the enzyme is derived from the eukaryotic gene. This enzyme is a catalyst, a competitive inhibitor of ADP, a substrate, a negative inhibitor of acid concentration, and a loop inhibitor. The reaction mechanism of [γ-^<32>P]ATP was studied. His273 in the α-terminal of this enzyme was used for its own acidification, and the binding of CoA to the α-terminal of this enzyme was shown. ADP is a reversible enzyme that inhibits the production of ATP. A key enzyme in the TCA loop is the citrate synthase(CS) and the same gene exists. The TCA loop of CS is composed of CO_2 fixation and generation products. This gene product shows 45% identity to the origin of E. coli, and the enzyme composition shows positive CS activity. This is the first time I've ever seen a woman. The enzyme is active in AMP and ADP, and its function in TCA loop/TCA loop direction and speed regulation is presumed. CO_2-fixing enzyme and biochemical analysis The enzyme is present in many organisms, and its decarbonization activity and carbon-fixing activity are similar.