光合成細菌由来炭酸固定経路である還元的TCA回路の分子生物学的解析

还原 TCA 循环（源自光合细菌的二氧化碳固定途径）的分子生物学分析

• 批准号: 13750735
• 负责人: 福居 俊昭
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13750735/
• 关键词: 緑色硫黄細菌; Chlorobium limicola; 還元的TCA回路; ATP-citrate lyase; citrate synthase; isocitrate dehydrogenase

還元的TCA回路は有機酸を代謝系の中心とした非Calvin回路型のCO_2固定系の一つであり、TCA回路の逆回転により4分子のCO_2から1分子のオキサロ酢酸を生成する。しかし、本回路におけるそれぞれの酵素的性質や反応機構の解析、遺伝子クローニングはこれまで詳しく行われていない。本研究は湖水より単離した緑色硫黄細菌Chlorobium limicola由来還元的TCAによるCO_2固定を分子レベルで明らかにすることを目的とした。ATP-citrate lyase(ACL)はATPを用いてクエン酸をオキサロ酢酸とアセチルCoAに開裂する逆クライゼン反応を触媒する興味深い酵素であり、原核生物では還元的TCA回路を有する生物にのみ存在している。我々はC. limicola由来ACL遺伝子のクローニングと異種宿主発現を行い、本酵素が真核生物由来酵素と異なるαβヘテロ構造を有していることを明らかにした。本酵素は逆反応を触媒せず、またADPによる競争阻害や、基質であるクエン酸濃度に応じた負の協同性を示し、回路の回転を制御していることを見出した。また[γ-^<32>P]ATPを用いた反応機構の検討により、本酵素のα-サブユニット中のHis273が自己リン酸化され、ついでリン酸基のクエン酸への転移とCoAとの結合によって生じたシトリル-CoAが開裂してオキサロ酢酸とアセチルCoAが生成することを示した。さらに、ADPは自己リン酸化された酵素と可逆的に反応してATPを再生することにより競争的に酵素反応を阻害することを示した。一方で、本菌ゲノムにはTCA回路の鍵酵素であるcitrate synthase(CS)の相同遺伝子が存在することを見いだした。CSは還元的TCA回路によるCO_2固定を阻害すると予想されることから、その発現および発現産物について検討した。本遺伝子産物は大腸菌由来CSと45%の相同性を示し、その組換え型酵素は確かにCS活性を示した。さらに本菌において本遺伝子が転写・翻訳されていることを見いだした。酵素的性質について検討したところ、本酵素はAMPおよびADPによって強く活性化されたことから、細胞内のエネルギー状態に応じた還元的TCA回路/TCA回路の方向や速度の調節に機能していることが推測された。また、CO_2固定酵素の一つであるisocitrate dehydrogenaseの遺伝子クローニングおよび生化学的解析を行った。本酵素は、多くの生物に存在するダイマー型とは異なるモノマー型酵素であり、中性付近では脱炭酸活性と同程度の炭酸固定活性を示すこと、オキサロ酢酸によって競争阻害を受けることを明らかとした。

Also yuan TCA loop は を organic acid metabolism is の center と し た non Calvin loop の CO_2 fixed to tie の つ で あ り の inverse, TCA, the loop planning に よ り 4 molecular の CO_2 か ら 1 molecular の オ キ サ ロ boggy acid を generated す る. し か し, this circuit に お け る そ れ ぞ れ の enzyme properties や の 応 authorities parsing, but 伝 ク ロ ー ニ ン グ は こ れ ま で detailed し く line わ れ て い な い. This study は lake よ り 単 from し た green sulfur bacteria Chlorobium limicola origin also yuan TCA に よ る CO_2 fixed を molecular レ ベ ル で Ming ら か に す る こ と を purpose と し た. ATP - citrate lyase (ACL) は を use ATP い て ク エ ン acid を オ キ サ ロ boggy acid と ア セ チ ル CoA に cracking す る inverse ク ラ イ ゼ ン anti 応 を catalyst す る tumblers deep い enzyme で あ り, prokaryotes で は there yuan TCA circuit を す る biological に の み exist し て い る. I 々 は c. limicola origin ACL heritage 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ と heterogeneous host 発 を い, now this enzyme が eukaryotes origin enzyme と different な る alpha beta ヘ テ ロ a し を construction て い る こ と を Ming ら か に し た. This enzyme は negative 応 を catalyst せ ず, ま た ADP に よ る competition resistance against や, matrix で あ る ク エ ン acid concentration に 応 じ た negative の collaborative を の し, the loop planning を suppression し て い る こ と を shows し た. ま た [gamma - ^ < > 32 P] を use ATP い た の 応 authorities beg に 検 よ り, this enzyme の alpha サ ブ ユ ニ ッ ト in の His273 が himself リ ン acidification さ れ, つ い で リ ン acid radical の ク エ ン acid へ の planning move と CoA と の combining に よ っ て raw じ た シ ト リ ル - CoA が cracking し て オ キ サ ロ boggy acid と ア セ チ ル CoA が Make する とを とを show た. さ ら に, ADP は リ ン acidification さ れ と reversible に た enzyme reverse 応 し て を ATP regeneration す る こ と に よ り competition に enzyme reverse 応 を resistance against す る こ と を shown し た. Party で, the bacteria ゲ ノ ム に は TCA loop の key enzyme で あ る citrate synthase (CS) の same heritage 伝 son が exist す る こ と を see い だ し た. CS は also yuan TCA loop に よ る CO_2 fixed を resistance against す る と to think さ れ る こ と か ら, そ の 発 now お よ び 発 now product に つ い て beg し 検 た. The 伝 offspring of this heritage, <s:1> escherichia coli, originated from CSと45% <s:1> homomorphism を indicated that the <s:1> and そ samples exchanged for え type enzymes <s:1> confirmed that the に にCS activity を indicated that the た た. さ ら に this bacterium に お い て this heritage 伝 son が planning to write, double 訳 さ れ て い る こ と を see い だ し た. The nature of the enzyme に つ い て beg し 検 た と こ ろ, this enzyme は AMP お よ び ADP に よ っ て strong く activeness さ れ た こ と か ら, intracellular の エ ネ ル ギ ー state に 応 じ た also yuan TCA loop/TCA の direction や speed の regulate に し て い る こ と が speculation さ れ た. ま た, CO_2 fixation enzyme の つ で あ る isocitrate dehydrogenase の heritage 伝 son ク ロ ー ニ ン グ お よ び line of biochemistry analytic を っ た. This enzyme は, more く の biology に す る ダ イ マ ー type と は different な る モ ノ マ ー type enzyme で あ り, neutral pay nearly で は decarburization acid active と の carbon acid fixed active を and shown the same extent す こ と, オ キ サ ロ boggy acid に よ っ て competition resistance against を by け る こ と を Ming ら か と し た.

项目成果

T.Kanao, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "ATP-citrate lyase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola is a heteromeric enzyme composed of two distinct gene products"Eur. J. Biochemistry. 268. 1670-1678 (2001)

T.Kanao、T.Fukui、H.Atomi、T.Imanaka：“来自绿色硫细菌 Chlorobium limicola 的 ATP-柠檬酸裂解酶是一种由两种不同基因产物组成的异聚酶”Eur。

T.Kanao, M.Kawamura, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Charcterization of isocitrate dehydrogenase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola : a carbon dioxide-fixing enzyme in the reductive tricarboxylic acid cycle"Eur. J. Biochemistry. 269. 1926-1

T.Kanao、M.Kawamura、T.Fukui、H.Atomi、T.Imanaka：“来自绿色硫细菌 Chlorobium limicola 的异柠檬酸脱氢酶的表征：还原三羧酸循环中的二氧化碳固定酶”Eur。

T.Kanao, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Kinetic and biochemical analyses on the reaction mechanism of a bacterial ATP-citrate lyase"Eur. J. Biochemistry. 269. 3409-3416 (2002)

T.Kanao、T.Fukui、H.Atomi、T.Imanaka：“细菌 ATP-柠檬酸裂解酶反应机制的动力学和生化分析”Eur。

T.Kanao, M.Kawamura, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Charcterization of isocitrate dehydrogenase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola : a carbon dioxide-fixing enzyme in the reductive tricarboxylic acid cycle"Eur. J. Biochemistry. (in press).

T.Kanao、M.Kawamura、T.Fukui、H.Atomi、T.Imanaka：“来自绿色硫细菌 Chlorobium limicola 的异柠檬酸脱氢酶的表征：还原三羧酸循环中的二氧化碳固定酶”Eur。

T.Kanao, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "ATP-citraic lyase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola is a heteromeric enzyme composed of two distinct gene products"Eur. J. Biochemistry. 268. 1670-1678 (2001)

T.Kanao、T.Fukui、H.Atomi、T.Imanaka：“来自绿色硫细菌 Chlorobium limicola 的 ATP-柠檬酸裂合酶是一种由两种不同基因产物组成的异聚酶”Eur。