海藻用発現ベクターの開発とそれを利用した海藻ゲノムへの外来遺伝子導入

开发海藻表达载体并利用它们将外源基因引入海藻基因组

• 批准号: 13760155
• 负责人: 柿沼 誠
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760155/
• 关键词: 海藻; 緑藻; 不稔性アオサ; 発現ベクター; 遺伝子導入; アクチン; 形質転換; プロモーター; リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ

申請者はこれまでに,不稔性アオサのアクチン遺伝子の全長を含む約12kbpのゲノムDNAの塩基配列解析により,アクチン遺伝子が5つのエクソンと4つのイントロンで構成されていること,翻訳開始および終結コドンがそれぞれ,第2および第5エクソンに存在すること,TATAボックスが転写開始点から30bp上流に,polyA付加配列が終結コドンから100bp下流に位置すること,等を明らかにしている。そこで,終結コドンから3'側約1.5kbpのDNA断片を,クロンテック社製プラスミドベクターpEGFPに含まれるGreen Fluorescent Protein(GFP)レポーター遺伝子の下流に挿入し,pEGFP-ACTを作製した。次いで,第1エクソンからプロモーター領域を含む5'側約1.2kbpのDNA断片,或いは第2エクソンの開始コドンからプロモーター領域を含む5'側約1.4kbpのDNA断片を各々pEGFP-ACTレポーター遺伝子の上流に挿入し,2種類の発現ベクターpEGFP-PSACTおよびpEGFP-PLACTを構築した。次に,構築した2種類の発現ベクターをバイオラッド社製PDS-1000/He Particle Delivery Systemを用いて種々の条件で不稔性アオサ細胞内に導入した。その結果,発現ベクターを直径1.0μmの金製マイクロキャリアにコーティングし,ヘリウム圧1300又は1550psi,サンプル距離6cmの条件で導入した場合に,細胞内に多数のマイクロキャリアが観察された。さらに,導入24時間後の細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ,いずれの発現ベクターを導入した場合でも,GFP由来の蛍光を発する細胞が数個確認された。また,GFP由来の蛍光強度の比較により,pEGFP-PSACTが細胞内でより強い発現性を示すことを明らかにした。今後は,より高効率で安定した形質転換体を得るための導入方法を確立すると共に,Luciferaseレポーター遺伝子を利用したプロモーター活性の測定により,導入外来遺伝子の発現に最適なプロモーター及びpolyA付加シグナル配列を決定する予定である。

The applicant responded that the total length of the non-fertile gene was about 12kbp and the nucleotide sequence analysis of the DNA sequence was carried out. The gene sequence was 5 kbp and the nucleotide sequence was 4 kbp. The nucleotide sequence was composed of the beginning and end of the sequence. The second and fifth nucleotide sequences were present. The TATA sequence was 30bp upstream from the beginning of the sequence. PolyA is added to the array to terminate the position of 100bp downstream. A DNA fragment of about 1.5 kbp on the 3'side of the terminal terminal region was detected, and pEGFP-ACT was detected downstream of the terminal region containing Green Fluorescent Protein(GFP). In the second place, the 1st solution contains a DNA fragment of about 1.2 kbp on the 5'side, or the 2nd solution contains a DNA fragment of about 1.4 kbp on the 5' side. Each of the pEGFP-ACT DNA fragments is introduced into the upstream of the pEGFP-PACT gene, and the 2nd solution contains a DNA fragment of about 1.4 kbp on the 5 'side. In addition, two kinds of PDS-1000/He Particle Delivery System were constructed and applied under the conditions of sterility and intracellular introduction. As a result, it was found that most of the particles in the cell were observed under the conditions of 1300 psi and 6 cm in diameter. In addition, 24 hours after the introduction, the cells were detected by fluorescence microscopy, and several cells were identified as GFP origin cells. In comparison with GFP,pEGFP-PSACT has strong intracellular expression. In the future, the introduction method of high efficiency, stable and qualitative transformation will be established. In addition, the determination of the activity of Luciferase gene will be carried out by using Luciferase gene. The optimal expression of Luciferase gene and polyA gene will be determined.