pHプローブ融合アドレナリンα_1受容体作成による受容体調節機構の解析

受容体細胞内移行と受容体蛋白が微小領域で受ける影響を同時に時空間的に定量できるプローブの開発を目指し今年度は以下に述べる実験を行った。1.H^+プローブの改良前年度作成した、H^+プローブは、他の細胞内イオン(クロライド等)により蛍光変化が起こることが報告され、現状のプローブでは充分に必要な情報が得られないと判断した。このため、理化学研究所宮脇先生よりクロライドに感受性の無いGFP変異体であるvenusの供与を受けプローブの改良を試みた。venusはH^+依存性が無いため、PCR法にてアミノ酸置換を行い、pH感受性のあるGFP変異体の検索を行った。クロライド感受性がなく、異なるH^+依存性をもついくつかの変異体を作成選択し、作成した変異体をGFPuvに融合したプローブ遺伝子を作成した。大腸菌でpHプローブ蛋白を作成し、蛍光強度比のpH依存性を蛍光分光光度計にて確認したところ380nmと480nmの励起による520nmの蛍光強度比は共にpH依存性を示し、pKaは6.8と7.4、8.0と異なるH^+感受性を示すプローブが作成でき、この蛍光スペクトルはEYFPで作成したものと同様であった。また、量子効率の改善が認められ作成した変異体のpHによる蛍光変化の程度はEYFPで作成したものに比べ大きく、よりS/N比の改善が認められた。2.生細胞でのpH可視化測定作成したプローブ遺伝子を培養細胞に導入し生細胞レベルでの可視化測定を試みた。H^+イオノフォアであるナイジェリシンの投与下に細胞外液のpHを変えた場合、外液pHの変化に依存してその蛍光強度比は変化し、そのpKaはリコンビナント蛋白と同様であった。今回改良を行ったGFP利用pHプローブも細胞レベルでも利用可能であり、in vitroの結果と同様に蛍光強度並びに変化の程度が増大しており、S/Nの改善並びに検出力の改善が認められた。3.α_1受容体融合pHプローブ安定発現細胞の作出α_1受容体融合pHプローブ安定発現細胞を作成し、その薬理学的特性の検討ならびに、細胞内移行に関わる因子を現在検討中である。

受容体細胞内移行と受容体蛋白が微小領域で受ける影響を同時に時空間的に定量できるプローブの開発を目指し今年度は以下に述べる実験を行った。1.H^+プローブの改良前年度作成した、H^+プローブは、他の細胞内イオン(クロライド等)により蛍光変化が起こることが報告され、現状のプローブでは充分に必要な情報が得られないと判断した。このため、理化学研究所宮脇先生よりクロライドに感受性の無いGFP変異体であるvenusの供与を受けプローブの改良を試みた。venusはH^+依存性が無いため、PCR法にてアミノ酸置換を行い、pH感受性のあるGFP変異体の検索を行った。クロライド感受性がなく、異なるH^+依存性をもついくつかの変異体を作成選択し、作成した変異体をGFPuvに融合したプローブ遺伝子を作成した。大腸菌でpHプローブ蛋白を作成し、蛍光強度比のpH依存性を蛍光分光光度計にて確認したところ380nmと480nmの励起による520nmの蛍光強度比は共にpH依存性を示し、pKaは6.8と7.4、8.0と異なるH^+感受性を示すプローブが作成でき、この蛍光スペクトルはEYFPで作成したものと同様であった。また、量子効率の改善が認められ作成した変異体のpHによる蛍光変化の程度はEYFPで作成したものに比べ大きく、よりS/N比の改善が認められた。2.生細胞でのpH可視化測定作成したプローブ遺伝子を培養細胞に導入し生細胞レベルでの可視化測定を試みた。H^+イオノフォアであるナイジェリシンの投与下に細胞外液のpHを変えた場合、外液pHの変化に依存してその蛍光強度比は変化し、そのpKaはリコンビナント蛋白と同様であった。今回改良を行ったGFP利用pHプローブも細胞レベルでも利用可能であり、in vitroの結果と同様に蛍光強度並びに変化の程度が増大しており、S/Nの改善並びに検出力の改善が認められた。3.α_1受容体融合pHプローブ安定発現細胞の作出α_1受容体融合pHプローブ安定発現細胞を作成し、その薬理学的特性の検討ならびに、細胞内移行に関わる因子を現在検討中である。