新規蛋白相互作用可視化技術によるG蛋白質共役型受容体調節機構の時空間的解析

受容体情報伝達機構可視化技術の基盤確立のため、α_<1b>受容体をモデルとしてGFP融合受容体の可視化法の確立・GFP融合による受容体機能の変化並びに、細胞内移行のメカニズムの検討を行った。〔生細胞での受容体可視化の実現〕GFP利用による受容体の細胞内局在の検討は困難である事が知られている。今回、蛍光の強い、hS65T-GFPを受容体に融合した遺伝子を作成し、αT3細胞に導入を行った。受容体の可視化のため、蛍光強度を指標とした選択法として、セルソーターを用いた。この方法により、GFP融合受容体強発現細胞を効率良く得ることが出来、生細胞レベルでの受容体分布・移動の検討が可能となった。〔GFP融合の受容体機能に対する機能の検討〕各種薬物に対する結合特性および細胞レベルでのCa^<2+>反応・IP_3産生については野生型α_<1b>受容体導入細胞との間に差は認められなかった。このことは受容体の機能である、情報伝達機構・薬物結合特性に対しての影響を最小限度にとどめながら、GFP融合は受容体移動の可視化検討が可能であることを示していると考えられた。〔受容体細胞内移行メカニズムの検討〕α_<1b>受容体を介する、既知の情報伝達系にかかわる刺激薬・拮抗薬を用い、可視化による細胞内移行機構の検討を行った。細胞内Ca^2の上昇のみでは、受容体の細胞内移行は認められないが、PKC活性化により受容体刺激と同等な細胞内への受容体の移行が認められた。また、内因性受容体(LHRH)刺激においても同様な細胞内移行が認められ、受容体細胞内移行にはPKCの活性化が必須であることが示された。〔結語〕生細胞ではこれまで困難であった受容体分布・移動のメカニズム検討がGFP融合受容体を作成することにより可視化検討することが可能となることを示し、GFP・FRETを利用した細胞内情報伝達系の時空間的解析・可視化技術の確立の実験基盤が達成されたと考えられる。

受容体情報伝達機構可視化技術の基盤確立のため、α_<1b>受容体をモデルとしてGFP融合受容体の可視化法の確立・GFP融合による受容体機能の変化並びに、細胞内移行のメカニズムの検討を行った。〔生細胞での受容体可視化の実現〕GFP利用による受容体の細胞内局在の検討は困難である事が知られている。今回、蛍光の強い、hS65T-GFPを受容体に融合した遺伝子を作成し、αT3細胞に導入を行った。受容体の可視化のため、蛍光強度を指標とした選択法として、セルソーターを用いた。この方法により、GFP融合受容体強発現細胞を効率良く得ることが出来、生細胞レベルでの受容体分布・移動の検討が可能となった。〔GFP融合の受容体機能に対する機能の検討〕各種薬物に対する結合特性および細胞レベルでのCa^<2+>反応・IP_3産生については野生型α_<1b>受容体導入細胞との間に差は認められなかった。このことは受容体の機能である、情報伝達機構・薬物結合特性に対しての影響を最小限度にとどめながら、GFP融合は受容体移動の可視化検討が可能であることを示していると考えられた。〔受容体細胞内移行メカニズムの検討〕α_<1b>受容体を介する、既知の情報伝達系にかかわる刺激薬・拮抗薬を用い、可視化による細胞内移行機構の検討を行った。細胞内Ca^2の上昇のみでは、受容体の細胞内移行は認められないが、PKC活性化により受容体刺激と同等な細胞内への受容体の移行が認められた。また、内因性受容体(LHRH)刺激においても同様な細胞内移行が認められ、受容体細胞内移行にはPKCの活性化が必須であることが示された。〔結語〕生細胞ではこれまで困難であった受容体分布・移動のメカニズム検討がGFP融合受容体を作成することにより可視化検討することが可能となることを示し、GFP・FRETを利用した細胞内情報伝達系の時空間的解析・可視化技術の確立の実験基盤が達成されたと考えられる。