プロテオーム解析を用いた、新たな内耳感染防御機構の解明

使用蛋白质组分析阐明针对内耳感染的新防御机制

• 批准号: 14770931
• 负责人: 長谷川 純
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770931/
• 关键词: 外リンパ; 内耳; 感染防御; 感染防御機構

我々は、2次元電気泳動による外リンパのプロテオーム解析を行っている。Cochlin蛋白のLCCLモチーフ配列に対する抗体を2種類作成し、抗LCCL-N末端抗体、抗LCCL-C末端抗体とした。これを用いた1次元ウェスタンブロッティングにより、外リンパ中に新規タンパクCochlin-Tomoprotein(CTP)(以前我々がPLP16K蛋白と呼んでいたもの)を検出した。CTPの前駆産物であるCOCH蛋白は分子量、等電点が異なる全部で16個のアイソフォームから構成されていた。従ってCTPも燐酸化、糖鎖の付加などの様々な翻訳後修飾を受けている可能性がある。そこで、先ずこの蛋白の発現を2次元電気泳動により解析する目的で実験を行った。ウシ外リンパを採取し、蛋白を20倍体積のホモジェネート液で抽出した。2次元電気泳動には固定化pH勾配ゲルストリップ(Immobiline pH3-10)を用いた。1次元目に尿素変性条件下で等電点泳動をMultiphorIIで行い、2次元目にSDS変性下で平板ゲル電気泳動を行った。この結果、外リンパ特異的な泳動パターンが得られ,これは内耳蛋白の泳動パターンとは全く異なっていた。20ulの外リンパを泳動し、抗LCCL-N末端抗体、抗LCCL-C末端抗体でウェスタンブロッティングを行ったところ、陽性スポットが検出された。この陽性スポットは、酸性側にCTP(pH7.7)分子量18.8から23.1kDa、アルカリ性側にCTP(pH7.9)分子量17.7から22kDaであり、CTPのアイソフォームと考えられた。今後、そのアミノ酸配列を解読し、PLP16K蛋白の蛋白レベルでの特徴、前駆産物であるCOCH蛋白との関連性を明らかにする。さらにCTPの機能について検討していく。

The analysis of two-dimensional electrical motion is carried out. Two types of antibodies against the LCCL sequence of Cochlin protein were prepared: anti-LCCL-N-terminal antibody and anti-LCCL-C-terminal antibody. This is the first time that we have used Cochlin-Tomoglobin (CTP)(formerly known as PLP 16K). CTP's precursor products include COCH, which has 16 different molecular weights and isoelectric points. It is possible that CTP phosphorylation, glycation and post-conversion modification may be affected. The protein expression of the protein was determined by two-dimensional electrokinetic analysis. The protein was extracted from the extract by 20 times the volume of the extract. 2-D Electrophoresis: Immobilization pH = 3-10 1-D isoelectric mobility under different conditions, 2-D isoelectric mobility under different conditions The result is that the protein in the inner ear is different from the protein in the outer ear. 20ul of the outer protein, anti-LCCL-N-terminal antibody, anti-LCCL-C-terminal antibody The molecular weight of CTP(pH7.9) is 17.7 kDa. The molecular weight of CTP(pH7.9) is 18.8 kDa. In the future, we will clarify the relationship between the protein sequence of PLP16K protein and COCH protein. The CTP function is currently in use.