ヒト角膜内皮細胞におけるDDBの機能的役割

DDB在人角膜内皮细胞中的功能作用

• 批准号: 14770974
• 负责人: 猪木 多永子
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770974/
• 关键词: damaged DNA-binding protein 2; DNA修復; 選択的スプライシング

角膜は日常的に紫外線に曝され、恒常的にDNA障害を受けると考えられる。一方、ヒト角膜内皮の遺伝子発現プロファイルの解析から、紫外線DNA障害の修復因子の一つであるDDB2(damaged DNA-binding protein 2)が特異的に発現することが明らかとなっている。角膜内皮におけるDDB2の機能解析を行うにあたり、我々はDDB2の選択的スプライシングの派生体を複数同定した。本年度はこれらDDB2派生体の同定と機能解析を行った。まず、HeLa細胞からRT-PCR法を用いて、選択的スプライシングにより生成される4種のDDB2派生体(D1-D4)を単離した。これらの予測分子量はそれぞれ、41kDa、28kDa、18kDa、27kDaであった。FLAGタグを付加した派生体タンパク質をHeLa細胞にて発現させ共焦点レーザー顕微鏡にて細胞内局在を検討したところ、すべてが核に局在した。これらのタンパク質をそれぞれ発現させた細胞を用いて、UV照射による障害DNA修復活性をELISA法にて検討したところ、野生型DDB2を導入細胞ではDNA修復は促進されたが、特にD1およびD2ではDNA修復活性はコントロール細胞より抑制される傾向が認められた。UV照射前後の細胞核内における局在では、野生型は障害DNA部位に凝集するが、D1およびD2派生体では凝集が認められなかった。またUV障害DNAを用いたゲルシフトアッセイでは、野生型がDNA-タンパク質複合体に結合するのに対し、D1およびD2派生体では複合体への結合が認められなかった。以上よりDDB2派生体D1、D2はDNA修復において抑制的に作用することが示され、またその作用機序はDNA障害部位への直接的な結合ではないことが示された。来年度は、これら派生体のDNA修復抑制における作用機序についてさらなる検討を深めると共に、培養角膜内皮細胞を用いて、DDB2高発現時のDNA修復を検討する予定である。

The daily UV exposure of cornea and the constant disturbance of DNA are affected. On the one hand, the corneal endothelium of the cornea has been detected, and the UV DNA barrier repair factor (DDB2 (damaged DNA-binding protein 2)) has been detected. The corneal endothelial cell DDB2 machine can analyze the number of derivatives selected by our DDB2 machine and determine the number of copies of the derivatives. This year, the DDB2 derivative will be the same as the mechanism to resolve the database. The HeLa cell RT-PCR method is used to generate DDB2 derivatives (D1-D4) isolates using the selected DDB2 derivatives. The molecular weight is different from that of 41kDa, 28kDa, 18kDa, and 27kDa. The FLAG derivative is sensitive to the HeLa cell. It shows that the cell is in common focus, the microcell is located in the cell, and the nuclear office is in the cell. The target cells were irradiated with UV, ELISA method, DNA repair activity, wild DDB2 cell implantation, DNA repair activity, D1 cell activation, D2 cell repair activity, DNA repair activity, and so on. Before and after UV irradiation, the nuclei of DNA were detected by agglutination at the sites of wild type and wild type, D 1 and D 2 derivatives. To prevent DNA from being damaged by UV, we used the combination of wild-type and wild-type genes to block DNA, and the combination of wild-type and D2-derived genes. The effects of the above DDB2 derivatives D1 and D2 on DNA repair and inhibition are shown in the sequence of the action mechanism and the DNA damage site is directly shown in combination with each other. In the coming year, DNA derivatives have been used to inhibit the action of DNA. In the coming year, we have studied the mechanism of inhibiting the effect of insulin, the number of cells in the cornea, the culture of corneal endothelial cells, and the use of DNA in high-temperature conditions.