DNA複製に伴うクロマチン構築機構及びその生命システムにおける意義の解明

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DNA複製フォークの通過に伴い一旦解離するヒストンは、新規に合成されるヒストンと共に複製後のDNA上に速やかに分配される。このDNA複製に伴うヌクレオソーム構築には、CAF-1やASF1といった特異なヒストン結合蛋白質群が関与する。我々はこれまで、この複製に伴うヌクレオソーム構築反応を解析するためのin vitroアッセイ系を世界に先駆け確立し、複製必須因子であるPCNAが、CAF-1による複製DNAと非複製DNAの識別に関与することなどを明らかにした。しかしながら、未同定活性の精製はもとより、CAF-1,ASF1がこの反応の中で果たす役割など反応機構の理解は進んでいなかった。今年度は、必要因子の同定・精製・解析を進める目的で、同ヌクレオソーム構築反応が、ヒストンH3.H4(H3H4)の配置、ヒストンH2A.H2B(H2A2B)の配置の2段階で進行することに着目し、個々のステップの進行に必要な活性の同定・解析を進めるための系を立ち上げた。ヒト293細胞由来のS100抽出液を、Phosphocelluloseカラムのある画分中には、DNA複製及びヌクレオソーム構築に必要なH2A.H2B以外の全ての活性が含まれる。SV40DNAの複製反応を、上述抽出液、ラージT-抗原及びCAF-1存在下に行うと、複製されたDNAにH3.H4が配置された状態で反応が停止する。この複製DNA-H3.H4前駆体をテンプレートに用い、H2A.H2Bを効率的に配置しヌクレオソームの構築を促進する活性の精製を進めている。加えて、この系は、CAF-1やASF1など既知因子の同ヌクレオソーム構築反応における役割の解析にも役立つ。さらに、同ヌクレオソーム構築反応の生命システムにおける役割を考察する目的で、高等植物シロイヌナズナの、CAF-1及びASF1変異株或いはその多重変異株を単離・解析している。