鶏卵リゾチームの甘味発現機構に関する研究

鸡蛋溶菌酶甜味表达机制的研究

• 批准号: 14760080
• 负责人: 桝田 哲哉
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760080/
• 关键词: sweet-tasting protein; lysozyme; chemical modification; positively charged residues; mutation; Pichia pastoris; sweet; lysine; arginine; isoelectric point; basic proteins

一般的に精製されたタンパク質は味を呈さないが、例外的に甘味を呈するタンパク質が知られている。熱帯植物由来のソーマチン、モネリンは古くから甘味を呈することが知られており、ソーマチンは食品素材、風味増強剤として食品業界で利用されている。鶏卵卵白中に存在する溶菌酵素リゾチームもまた甘味を呈する。鶏卵卵白リゾチームは分子量14,500、分子内にリジン残基6残基、アルギニン残基11残基を有する等電点11の塩基性タンパク質であり、その甘味閾値は約7μMである。しかしながら、リゾチームのどの部位が甘味発現に重要な役割を担っているのかの知見はほとんどない。そこで本研究は、リゾチームの塩基性アミノ酸残基である、リジン及び、アルギニン残基にターゲットを絞り、化学修飾法、および遺伝子工学的手法を用いてリゾチームの甘味発現機構を明らかにすることを目的とした。まず化学修飾はリジン残基側鎖のε-アミノ基のグアニジル化(Gua)、アセチル化(Ac)、ホスホピリドキサール化(PLP)により行った。またAc化、PLP化したリゾチームについては、SP陽イオン交換カラムを用いて精製を行い、修飾度合いの異なる修飾体を得た。PLP化したリゾチームについては、再び脱リン酸化を行った。これらリゾチームの甘味特性評価は人による三点識別法にて行い、その甘味閾値を求めた。Guaリゾチームは甘味閾値にほとんど影響を与えなかったが、Ac及びPLPリゾチームの甘味閾値は修飾度合いが高まるにつれ顕著に増大した。また閾値の上昇したPLPリゾチームの脱リン酸化を行ったところ、再び甘味閾値が減少したことから、リゾチームの甘味発現にはリジン残基側鎖の構造的要因ではなく、塩基性度が重要であることが明らかになった。化学修飾法の結果を考慮し、メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用い、部位特異的変異にて詳細に甘味発現に係わる残基を検討した。その結果、Lys13,Lys96,Arg14,Arg21,Arg73の5残基が甘味発現に重要な役割を果たすことが明らかとなった。

General に refined さ れ た タ ン パ ク qualitative は flavour を show さ な い が, exception に umami を show す る タ ン パ ク qualitative が know ら れ て い る. Hot 帯 plant origin の ソ ー マ チ ン, モ ネ リ ン は ancient く か ら umami を show す る こ と が know ら れ て お り, ソ ー マ チ ン は food material, flavor raised strong tonic と し で て food industry use さ れ て い る. In the 鶏 egg white, に contains する lysozyme リゾチ ム ム また また and the sweet taste を is する. 鶏 egg albumen リ ゾ チ ー ム は molecular weight 14500, intramolecular に リ ジ ン residues 6 residues, ア ル ギ ニ ン residues 11 residues を have す る isoelectric point 11 の salt basic タ ン パ ク qualitative で あ り, そ の umami threshold numerical は about 7 microns で あ る. し か し な が ら, リ ゾ チ ー ム の ど の parts が umami 発 に important cut を な service now bear っ て い る の か の knowledge は ほ と ん ど な い. そ こ で は, this study リ ゾ チ ー ム の salt basic ア ミ ノ acid residues で あ る, リ ジ ン and び, ア ル ギ ニ ン residues に タ ー ゲ ッ ト stranded を り, chemical modification method, お よ び but 伝 sub engineering technique を with い て リ ゾ チ ー ム の umami 発 institutions now を Ming ら か に す る こ と を purpose と し た. ま ず chemically modified は リ ジ ン residue side chain の epsilon - ア ミ ノ base の グ ア ニ ジ ル (Gua), ア セ チ ル (Ac) and ホ ス ホ ピ リ ド キ サ ー ル change (PLP) に よ り line っ た. ま た Ac, PLP し た リ ゾ チ ー ム に つ い て は, SP Yang イ オ ン exchange カ ラ ム を with い て refined を line い, modified degrees い の different な る modify body を た. PLP is carried out to たリゾチ たリゾチ ムに ムに ムに て て て, then び deacidify リ and った. <s:1> れらリゾチ ム ム <s:1> evaluation of sweet taste characteristics 価 めた human による three-point recognition method にて to determine めた and そ <s:1> sweet taste threshold を めた. Gua リ ゾ チ ー ム は umami threshold numerical に ほ と ん ど influence を and え な か っ た が, Ac and び PLP リ ゾ チ ー ム の umami threshold numerical は modification degree or い が high ま る に つ れ 顕 に raised large し た. Rising ま た threshold numerical の し た PLP リ ゾ チ ー ム の リ off line ン acidification を っ た と こ ろ, again び umami threshold numerical が reduce し た こ と か ら, リ ゾ チ ー ム の umami 発 now に は リ ジ ン residue side chain の structure will で は な く, salt basic important で が あ る こ と が Ming ら か に な っ た. Chemical modification method の results を し, メ タ ノ ー ル endowment nature yeast Pichia pastoris を い, site specific - different に て detailed に umami 発 に is now わ る residues を beg し 検 た. そ の results, Lys13 Lys96 Arg14, Arg21, Arg73 の 5 residues が umami 発 に now important な "を cut fruit た す こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

High yield secretion of the sweet-tasting protein lysozyme from the yeast Pichia pastoris

• DOI: 10.1016/j.pep.2004.09.009
• 发表时间: 2005-01-01
• 期刊: PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION
• 影响因子: 1.6
• 作者: Masuda, T;Ueno, Y;Kitabatake, N
• 通讯作者: Kitabatake, N

T.Masuda et al.: "Cloning, expression, and characterization of recombinant sweet-orotein thaumatin II using methylotrophic yeast Pichia pastoris"Biotechnology and bioengineering. 85. 761 (2004)

T.Masuda 等人：“使用甲基营养酵母毕赤酵母进行重组甜蛋白索马甜 II 的克隆、表达和表征”生物技术和生物工程。

T.Masuda et al.: "Monitoring the Irradiation-induced Conformational Changes of Ovalbumin by Using Monoclonal Antibodies and Surface Plasmon Resonance"Biosci.Biotechnol.Biochem. 64. 710 (2000)

T.Masuda 等人：“通过使用单克隆抗体和表面等离子共振监测辐射诱导的卵清蛋白构象变化”Biosci.Biotechnol.Biochem。

Effects of chemical modification of lysine residues on the sweetness of lysozyme

• DOI: 10.1093/chemse/bji021
• 发表时间: 2005-03-01
• 期刊: CHEMICAL SENSES
• 影响因子: 3.5
• 作者: Masuda, T;Ide, N;Kitabatake, N
• 通讯作者: Kitabatake, N

T.Masuda: "Sweetness and Enzymatic Activity of Lysozyme"Journal Agricultural and Food Chemistry. 49. 4937 (2001)

T.Masuda：“溶菌酶的甜味和酶活性”农业和食品化学杂志。